Tpe aB E1① 图6各种Type的 CRISPR【16】 CRISPR系统也是有很多Type的,不同细菌中含有的 CRISPR的type 也不一样。上图是2013年的一篇非常棒的 review当中对几种type作用机制 的整理。(是不是几年之后绝对入主教科书呢?不入也没道理啊。)在这里,也要 提醒大家特别注意type-Ⅱ,因为后面的故事,Cas9将会扮演绝对主角 似曾相识,本是同根生? 看了上面的流程图,我想大家都会觉得“面熟”,没错,看了下面的一张 比较图,更会觉得原核真核之间机制的相通性。也许,我们的差距没有想象中那 么大
图 6 各种 Type 的 CRISPR【16】 CRISPR 系统也是有很多 Type 的，不同细菌中含有的 CRISPR 的 type 也不一样。上图是 2013 年的一篇非常棒的 review 当中对几种 type 作用机制 的整理。（是不是几年之后绝对入主教科书呢？不入也没道理啊。）在这里，也要 提醒大家特别注意 type-II，因为后面的故事，Cas9 将会扮演绝对主角。 似曾相识，本是同根生？ 看了上面的流程图，我想大家都会觉得“面熟”，没错，看了下面的一张 比较图，更会觉得原核真核之间机制的相通性。也许，我们的差距没有想象中那 么大
CRISPR- mediated interference Eukaryotic RNA-interference Foreign DNA Foreign RNA Nudeus CRISPR locus coooooooc.o Source piRNA locus IRNA locus RepeatRepeat Repeat CRISPR transcription Drosha do mIRNA SiRNA Cas or RNase Ill RNA biogenesis crRNA-guided surveillance complex RNA-induced silencing complex Cas protein(s) AGO/PIWI NA- guided interference Target interference 图7和真核RNAi比较 Parallels and distinctions between CRISPR RNA guided silencing systems and RNAi.【11】 深入了解,为“我”所用,指哪打哪 Cas9等机理研究和工具改造 故事如果就到这里,那虽然有趣,充其量也只算是认识自然。其实,真正 的好戏才刚刚开始。 随着 CRISPR重要性的逐渐显现对它的作用机理硏究也一步步深入』【10】 【14】【16】各个方面,各种类型的蛋白作用渐漸清楚。比如如何将 spacer整 合如基因组?【14】中,Csn2作用的模型建立
图 7 和真核 RNAi 比较 Parallels and distinctions between CRISPR RNAguided silencing systems and RNAi.【11】 二、 深入了解，为“我”所用，指哪打哪 ——Cas9 等机理研究和工具改造 故事如果就到这里，那虽然有趣，充其量也只算是认识自然。其实，真正 的好戏才刚刚开始。 随着 CRISPR 重要性的逐渐显现，对它的作用机理研究也一步步深入。【10】 【14】【16】各个方面，各种类型的蛋白作用渐渐清楚。比如如何将 spacer 整 合如基因组？【14】中，Csn2 作用的模型建立
Opening of the CRISPR array as1. Cas2? Repeat duplication through ll-in by polymerase Binding of Csn2 to the DNA-ends 非 of DNA-repair proteins(Ku- like activity) 图8Csn2参与整合 spacer模型 移花接木,给细菌打“疫苗 于是就有人在想,既然这看起来是个不错的免疫体系,既然大肠杆菌中这 个体系看似不够强悍,能不能移植啊? 答案是肯定的。2011年,NAR杂志上,法国的一个课题组【4】正是做了 这样的一件事情—将 Streptococcus thermophilus嗜热链球菌中的 Type-I CRISPR系统利用质粒系统移植到了大肠杆菌当中,发挥了作用!于是他们很愉 悦的得出了结论— CRISPR是可以用来给细菌打疫苗的,我们了解他的天敌, 就可以主动防御,先发制人 同时,几乎是“顺带”,他们还发现了2件事情
图 8 Csn2 参与整合 spacer 模型 移花接木，给细菌打“疫苗”！ 于是就有人在想，既然这看起来是个不错的免疫体系，既然大肠杆菌中这 个体系看似不够强悍，能不能移植啊？ 答案是肯定的。2011 年，NAR 杂志上，法国的一个课题组【4】正是做了 这样的一件事情——将 Streptococcus thermophilus 嗜热链球菌中的 Type-II CRISPR 系统利用质粒系统移植到了大肠杆菌当中，发挥了作用！于是他们很愉 悦的得出了结论——CRISPR 是可以用来给细菌打疫苗的，我们了解他的天敌， 就可以主动防御，先发制人。 同时，几乎是“顺带”，他们还发现了 2 件事情
1、Cas9“-粒起效”——作为唯需要的,足以起作用的剪切蛋白(强悍 性充分性 2、Cas9“左膀右臂“——起作用依赖 McrA/HNH-和RuvC/ RNaseh 这两个mot.。从此Cas9也从那么多Type【16】的 CRISPR的蛋白中,款款 走入了我们的视线。 s1cas2csn c10° 21 □ PACYC184 Figure 2. CRISPR3, Cas system of S thermophiles provides i ion in E. col cclk. (A) Schematic represe 图9利用质粒实现Cas9-嗜热链球菌￠ RISPR系统往大肠杄菌的移植 所以说第一次他们证明了 CRISPR不但可以免疫自己还可以异源表达, 免疫他人,这就是“疫苗”啊,很有意思。 然而从故事的后续发展来看(如果我梳理的逻辑中没有落掉太多东西),他 们实在浪费了一块宝藏,大材小用了。而这篇文章结果的重要性也被研究者本身 严重低估了。不能说他们愉悦的结论和细菌的疫苗不重要,只能说他们只看透了 层,没有看到更深的一层,没有看得更远 为什么这么说,因为虽然他们没看到,但是有人看到了。并且真正成功的
1、Cas9“一粒起效”——作为唯一需要的，足以起作用的剪切蛋白（强悍 性充分性）。 2、Cas9“左膀右臂“ ——起作用依赖 McrA/HNH- 和 RuvC/RNaseH 这两个 motif. 。从此 Cas9 也从那么多 Type【16】的 CRISPR 的蛋白中，款款 走入了我们的视线。 图 9 利用质粒实现 Cas9-嗜热链球菌 CRISPR 系统往大肠杆菌的移植 所以说第一次，他们证明了 CRISPR 不但可以免疫自己，还可以异源表达， 免疫他人，这就是“疫苗”啊，很有意思。 然而从故事的后续发展来看（如果我梳理的逻辑中没有落掉太多东西），他 们实在浪费了一块宝藏，大材小用了。而这篇文章结果的重要性也被研究者本身 严重低估了。不能说他们愉悦的结论和细菌的疫苗不重要，只能说他们只看透了 一层，没有看到更深的一层，没有看得更远。 为什么这么说，因为虽然他们没看到，但是有人看到了。并且真正成功的
奥秘就在于那两件顺带的发现。 粒起效”,果断改造——从此剑锋直指! 如果要在 CRISPR系统的硏究中树一块里程碑,我想【2】他是。如果要在 这个故事里有个转折,我想他【2】也是。从这里开始, CRISPR的传奇将开始上 演,新代分子生物学革命的帷幕即将拉开! 2012年8月17,一篇看似低调的 Science,看那些胶图和data也没什么 意思,这里用我的语言简单总结一下他们主要做了些什么 (1)证实 tracrrNA, rrnA都是必须的(type特 征) (2)(3)看看Cas9到底在哪里切开?怎么切?--确 定切点2个 domain各切一条 (4)2个RNA不能缺哪段?—确定可介导的 CRNA和 tra rrnA最小区域 (5) seed region不能缺哪段?- protospacer sequence requirements最小区域 (6) PAM motif(NGG,防自身免疫)咋作用? i让ilr抱紧~开个Rop 是的,流水账一样,到这里这文章看起来没啥难度,也没啥亮点。但是 细心地你发现了吗,到这里,他们已经一步一步的把Cas9作为定向内切酶的每 一步机制,方方面面都搞清楚了。 插句,又有一个被忽略(至少在这篇文章里没大动作)的意外惊喜—2个 “左膀右臂" domain是各切一条链 HNh domain切 complementary DNA strand, RuvC-like domain tJ noncomplementary DNA strand
奥秘就在于那两件顺带的发现。 “一粒起效”，果断改造——从此剑锋直指！ 如果要在 CRISPR 系统的研究中树一块里程碑，我想【2】他是。如果要在 这个故事里有个转折，我想他【2】也是。从这里开始，CRISPR 的传奇将开始上 演，新一代分子生物学革命的帷幕即将拉开！ 2012 年 8 月 17，一篇看似低调的 Science，看那些胶图和 data 也没什么 意思，这里用我的语言简单总结一下他们主要做了些什么： 是的，流水账一样，到这里这文章看起来没啥难度，也没啥亮点。但是， 细心地你发现了吗，到这里，他们已经一步一步的把 Cas9 作为定向内切酶的每 一步机制，方方面面都搞清楚了。 插一句，又有一个被忽略（至少在这篇文章里没大动作）的意外惊喜——2 个 “左膀右臂“domain 是各切一条链，HNH domain 切 complementary DNA strand， RuvC-like domain 切 noncomplementary DNA strand