初期的细胞固定化技术经常用于发酵工业,但是日趋严重的水环境污染问题对废水生 細T甘宜頤泊庙们甜阻围φ心州咖和的州A
Southern印迹杂交技术检验,发现融合细胞中带有双亲细胞的DNA序列。 将融合细胞FET和具有纤维素分解能力的革兰阳性菌白色瘤胃球菌(Rum albus)进行融合,将纤维素分解基因引人到FET菌株中,获得1株革兰阳性重组子,它 具有 ruminococcus albus亲株45%左右的β-葡萄糖苷酶和纤维二糖酶活性,同时还具有 87%FET降解DV酶的活性。利用基因探针技术证实它是一个完全的融合子 (2)芳香族降解菌的构建 Pseudomonas alcaligenes Co可以降解苯甲酸酯和3-氯苯甲酸酯,但不能利用甲苯, 而 Pseudomonas putida R53可以降解苯甲酸酯和甲苯,但不能利用3-氯苯甲酸酯。上述 两菌株均不能利用1,4-二氯苯甲酸酯,通过细胞融合,得到的融合细胞可以同时降解上 述4种化合物,这一结果说明原生质体融合可以集中双亲的优良性状,并可产生新的 性能。 将乙二醇降解菌 Pseudomonas mendocina3RE-15和甲醇降解菌 Bucillus lentus3RM2中 的DNA转化至苯甲酸和苯的降解菌 Acinetobacter calcoaceticus T3的原生质体中,获得 的重组子TEM1可同时降解苯甲酸、苯、甲醇和乙二醇,降解率分别为100%、100% 84.2%、63.5%。此菌株用于化纤废水处理,对COD去除率可达67%,高于三菌株混合 培养时的降解能力。 2.3.2.2抗污染型植物 植物细胞工程的首要目的是获得各种符合人类需要的植物品种,其中以农作物占多 数。早期的研究集中在培育高产量的新品种。现在人们研究得更多的则是将各种抗性基因 转移到植物体内,以使它们获得对昆虫、病毒、除草剂、环境污染、衰老等的抗性,还可 以认为对植物花卉、果实进行修饰改造等。 目前已培育出多种抗性植物,如抗虫、抗病毒、抗除草剂、耐受环境压力(包括抗 旱、抗热、抗寒)等的改良植物。 2,3.2.3免疫分析与环境监测 有机化合工业的发展及其化合物的广泛应用导致环境污染日益加剧。欧盟已制定出法 规,要求饮用水中某些有机物的浓度小于01pg/L,这就要求有与之配套的日常检测分析 技术。现行的标准方法有高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)和质谱(MS)法 但这些方法的技术要求高,费用昂费。相比较而言,免疫分析技术快速、简单、便宜 2.4发酵工程及其在环境污染防治中的应用 2.4.1发酵工程概述 发酵工程是将微生物学、生物化学和化学工程学的基本原理有机地结合起来,利用 微生物的生长和代谢活动来生产各种有用物质的工程技术。发酵工程具有悠久历史,同时 又融合了现代科学技术的成果,是现代生物技术的重要组成部分,是生物技术产业化的重 要环节 2.4.1.1发酵的含义 发酵( fermentation)最初来自拉丁语“发泡”( fervent)这个词,是指酵母作用于果汁 或发芽谷物产生二氧化碳的现象。巴斯德研究了乙醇发酵的生理意义,认为发酵是酵母在无
氧状态下的呼吸过程,是“生物获得能量的一种形式”。也就是说,发酵是在厌氧条件下 酵母等生物细胞对糖进行分解代谢,向菌体提供能量,从而得到产物酒精和二氧化碳的过 程。然而,发酵对不同的对象具有不同的意义。对生物化学家来说,它是指有杋物分解代谢 释放能量的过程,对工业微生物学家来说,它的意义就广泛得多,把利用微生物在有氧或无 氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或其代谢产物的过程统称为发酵,发酵的定义目前 扩展到培养生物细胞(动、植物细胞和微生物细胞)来制得产物的所有过程 2.4.1.2发酵工业的历史回顾 早在几千年前,人们就开始从事酿酒、制酱、制奶酪等生产,然而人类在漫长的岁月 中对发酵的本质无所知,产物的生产也处在原始方式。直到1675年,荷兰人雷文虎克 发明了品微镜,才首次观察到大量活着的微生物。被称为微生物学鼻祖、发酵学之父的法 国生物学家巴斯德首次证明酒精发酵是酵母菌引起的,认识到发酵现象是由微生物所进行 的化学反应,各种微生物在发酵过程具有不同的反应,对发酵的生理学意义有了认识。随 后,柯赫建立了单种微生物的分离和纯培养技术。另…方面,德国科学家布赫纳阐明了微 生物产生化学反应的本质。他用磨碎的酵母细胞制成酵母汁,加入大量蔗糖后,也发现有 大量CO2和乙醇形成,证明了任何生物都有引起产生发酵的物质(酶) 从19世纪末到20世纪30年代,微生物培养技术不断进步,许多新发酵产品逐渐问 世,如乳酸、乙醇、甘油、丙酮、丁醇、柠檬酸、淀粉酶和蛋白酶等相继问世,但发酵技 术本身并无很大的进步。此时的发酵大多数为使用原料来源简单、设备要求低的固态发酵 和浅层液态发酵。这是一种生产工艺简单、规模小、操作粗放的开放式发酵。 发酵工程真正成为科学技术开始于20世纪40年代初抗生素大规模深层发酵工业的建 立。第二次世界大战期间,需要大量的青霉素,但因生产技术水平低下,难于满足需求 因此迫切需要提高生产效率、产量和质量,促使人们对发酵技术进行深人研究;人们开始 改变固体表面培养,采用液体深层培养;为了解决深层培养的各种技术要求,如无菌、通 气、混合等,开发了机被搅拌式的、可通入无菌空气的密封式发酵罐,利用这样的发酵罐 和技术,再配以离心、溶剂萃取和冷冻干燥等技术,使青霉素的发酵水平从表面培养的发 酵效价40单位/ml、收率20%、产品纯度20%的水平提高到发酵效价200单位/ml、收率 75%、产品纯度60%,使发酵所需的占地面积、劳动强度、能量消耗等大大减少。随后, 链霉素等抗生素相继问世,抗生素工业迅速发展,使微生物发酵工业进入了一个崭新的发 展阶段,同时也带动了其他发酵产品的发展 20世纪60年代初期,在开发微生物菌体为饲料蛋自的研究中,发酵工业取得了许多 进展,开发出了氧传递效率高的加压喷射发酵罐和加压循环发酵罐。以石油为原料的发酵 有了明显进步,可用于生产单细胞蛋白、有机酸(如柠檬酸、谷氨酸等),开辟了非粮食 发酵技术新领域,这一时期的发酵特点是产品种类多,不但有初级代谢产物,如氨基酸、 酶制剂、有机酸等,也有次级代谢产物,如抗生素、多糖等。发酵技术和工艺、优良菌种 的选育技术有了较大发展。新产品、新工艺、新设备不断涌现,并得到广泛应用,使发酵 工业发生了巨大变化 20世纪70年代发展起米的基因工程技木使发酵工业进入了新时期,随着基因工程技 术的发展,人们可以按照预先的设计,在生物体外进行基因重组,并克隆到微生物细胞 中,构建基因工程菌。 利用工程菌,可以大量生产原来微生物所不能产生的物质,如胰岛素、干扰素、白细
胞介素等,细胞融合技术也可以创造出许多具有特殊功能和多功能的新菌株,再通过发 酵,生产新的有用物质,这些都是现代发酵工程的重要进展。使徽生物发酵产品不断增 加。发酵工艺现已扩展到动物和植物细胞的培养领域,使过去只能从动、植物中提取的 些产品现在也能成为发酵产品。 基因工程、蛋白质工程、细胞融合等技术为人们开创了构造具有各种生产能力、性能 优良的物种的新天地,为发酵工程增添了新的活力,使现代发酵产品的发酵水平极大提 高。但是,充分发挥它们的作用仍然需要依靠发酵技术的进展。为使利用各种手段得到 新物种能够大量、高效、高质量地生产,需要解决在大规模培养过程中必须解决的所有问 题,这就是现代发酵工程的研究内容。 近年来,随着代谢调控技术、连续发酵技术、高密度培养技术、固定化细胞技术、反 应器设计、发酵与分离偶联技术、在线检测技术、自控技术、产物的分离纯化等所需技术 的发展以及工艺、设备和工程研究的进步,发酵工业达到了一个新的高度,发酵工业的自 动化、连续化已成可能。 仍以青霉素发酵为例,回顾一下在半个多世纪里的变化历程。在遗传育种、培养基改 进、发酵工艺控制等方面进行了大量工作,用于生产的菌种的发酵效价逐年提高。特别是 利用基因工程将青霉素生物合成过程中的关键酶的基因克隆到生产菌种中,利用代谢调 控,控制发酵副产物的产生,经发酵动力学的深入研究,建立了发酵动力学模型,采用流 加发酵的变湿发酵技术,利用计算机进行发酵过程控制,对碳源、氮源、前体、pH值、 搅拌速度、通气量、罐压、温度和溶解氧等诸多参数进行自动控制和关联控制,生产规模 已达到500m3的发酵罐,发酵效价儿乎提高近2000倍。在产品分离纯化上,收率达到 90%,产品纯度达99.9%以上。可以看出,除遗传、基因工程育种大幅度提高菌种的生 产能力以外,发酵工程的进步,如工艺技术、工程设备、检测挖制等方面的发展对青霉素 工业生产水平的提高起到了关键作用。 发酵技术虽有着悠久的历史,但作为现代科学概念的发酵工业,是在20世纪40年代 随着抗生素工业的兴起而得到迅速发展的。现代发酵工程又是在传统发酵的基础上结合了 DNA重组、细胞融合、分子修饰和改造等新技术进行进一步完善的。日前,现代发酵工 业已形成完整的工业体系,包括抗生素、氨基酸、有机溶剂、多糖、酶制剂、单细胞蛋 白、维生素、基因工程药物、核酸类物质以及其他生物活性物质等的生产;其产品在医 药、食品、化工、轻工、纺织、环境保护等诸多领域获得广泛应用,成为与人们的衣、 食、住、行、环境与健康等密切相关的产业。发酵工业已成为全球经济的重要组成部分 在有些发达国家,发酵工业的产值占国民生产总值的5%,在医药产品中,发酵产品也占 有重要位置,其产值占20% 发酵工程的主体为利用微生物,特别是经DNA重组技术改造的微生物来生产有用物 质。发酵工程的内容随着科学技术的进步而不断扩展和充实。现代发酵工程不仅包括菌体 生产和代谢产物的发酵生产,还包括微生物机能的利用 现代发酵工程需要两方面的专家通力合作,即分子生物学家负责分离、鉴定、改造甚 至创造可在微生物内高效表达的基因,以应用于工业生产。而生化工程技术人员则要保证 改造过的微生物能在最适宜条件下大量生产,以获得最大产率。 因此,发酵工程的内容包括生产菌种的选育,发酵条件的优化与控制,反应器的设计 及产物的分离、提取与精制等
2.4.2固态发酵与固体废弃物处理 2.4.2.1固态发酵 根据某些微生物生长需水很少的特性,可利用蜿松而含有必需营养物的固体培养基进 行发酵生产,这种发酵类型称为固态发酵。中国传统的酿酒、制酱均叮归类为固态发酵。 此外,固态发酵也包括动、植物废料的堆肥等 固态发酵所用原料一般为经济易得、富含营养物质的工农业生产的副、废产品,如麸 皮、薯粉、高粱、玉米粉等。根据需要,有时还对原料进行粉碎、蒸煮等预加工,以促进 营养物吸收,改善发酵生产条件,有时需加入尿素等营养物 固态发酵一般都是开放式的,因而不是纯培养,无菌程度要求不高。它的一般过程 为:将原料预加工后再经蒸煮灭菌,然后添加一定量水分,接入预先培养好的菌种进行发 酵,发酵成熟后适时出料,并进行适当处理或进行产物的提取。 固态发酵具有设备简单,操作容易,并可因陋就简、因地制宜地利用一些来源丰富的 工农业副产物等优点。其缺点是劳动强度大、不便于机械化操作、微生物品种少且生长 慢、产品有限等 2.4.2.2固体废弃物处理 固体废弃物可分为有机废物和无机废物。其中有机固体废弃物(亦称垃圾)来自各种 生活废弃物如厨余(食物废料和残余)、丢弃的包装纸、塑料袋、废旧纸张和破布等。随 着副食品加工工业的发展和菜场供应的革新,菜渣、烂瓜果日益增多,城市居民每日丢弃 的生活垃圾量日益增多。有机固体废弃物的组分发生变化,多含有难生物降解的塑料,使 废弃物的处理难度增加。有机囿体废弃物生物处理之前要进行分选,将塑料之类的极难降 解物剔除,再进人生物处理装置,而且有机固体废弃物的量和质受季节的影响,如夏季瓜 皮泛滥,若不及时处理会极大影响环境卫生和人体健康。 根据废物利用和变废为宝的原则,厨余可喂绪,还可经微生物发酵做成复合饲料或作 为农肥;树叶、杂草可肥田;废弃包装纸、塑料袋、废旧纸张和破布可回收,综合利用, 由于城市人口膨胀,丢弃的垃圾越来越多,要用各种减量的方法及时妥善处置,还要卫 生化。 当前各国城市采用的垃圾处置和处理方法主要有堆肥法、墳埋法和焚烧法。堆肥法和 填埋法是生物方法,用以处理可生物降解的有机固体废弃物;焚烧法是物理方法,它用来 处理不可随意排放、有危险的特种废物,也处理城市污水厂的剩余污泥和生活垃圾。 关于固体有机废物的生物处理技术,本书将在第4章做详细介绍,在此不再整述