①工具酶20世纪4~60年代,虽然从理论上确立了基因工程的可能性,为基因工 程未来的发展设计了一幅美好的蓝图,但是科学家们面对如此庞大的双链DNA分子,仍 然觉得束手无策,不能把它切割成单个的基因片段。尽管那时酶学知识已得到相当的发 展,但没有任何一种酶能对DNA进行有效地切割 1970年, Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶 HindⅡ使DNA分子的切割成为可能。1972年, Boyer实验室又发现了 Eco R I核酸 内切酶。随后又相继发现了大量类似于 Eco R I的限制性核酸内切酶,从而使研究者 可以随意地获得所需的DNA特殊片段,为基因工程提供了技术支持。对基因工程技 术的突破起重要作用的另一发现是DNA连接酶。1967年,世界上5个实验室几乎同 时发现了DNA连接酶。1970年,美国 Khorana实验室发现了TDNA连接酶,具有 更高的连接活性。 ②载体有了对DNA切割和连接的工具酶,还不能完成DNA体外重组的工作,因 为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。为了能够在宿主细胞中进行繁殖,必须将 DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制能力的DNA分子上。这种DNA分子就是基 因工程载体。基因工程载体的研究先于限制性核酸内切酶。从1946年起, Lederberg开 始研究细菌的性因子一F因子,以后相继发现其他质粒,如耐药性因子(R因子)、大 肠杆菌素因子(CoF)。1973年,S. Cohen首先将质粒作为基因工程的载体使用 ③逆转录酶1970年, Baltimore等人和 Temin等人同时各自发现了逆转录酶,打 破了中心法则,使真核基因的制备成为可能。 具备了以上的理论与技术基础,基因工程诞生的条件已经成熟。1972年,斯坦福大 学的P.Berg等人在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶 ECc0RI,在体外对猿猴病毒Sv40的DNA和A噬菌体的DNA分别进行酶切,再用 T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来,获得了重组DNA分子 1973年,斯坦福大学的S. Cohen等人成功地进行∫另一个体外重组DNA实验并成 功地实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌的抗四环素(TC")质粒pSC101和抗新 霉素(Ne)及抗磺胺(S)的质粒R6-3,在体外用限制性内切酶 EcoR I切割,连接成 新的重组质粒,然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中,选出了抗四 环素和抗新霉素的重组菌落,即表型为TCNe'的菌落,这是基因工程发展史上第一次实 现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生。 2.2.1.2基因工程的内容 (1)基因工程的定义 将外源基因通过体外重组后导人受体细胞内,使这个基因能在受体细胞内复制、转 录、翻译表达的操作过程,称为基因工程。 基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表 达等全过程,因此基因工程又称为DNA重组技术,是在分子水平上对基因进行操作的复 杂技术,基因工程的实施至少要有4个必要条件:(a)工具酶;(b)基因;(c)载体;(d)受 体细胞 从本质上讲,基因工程强调了外源DNA分子的重新组合,即被引入到一种新的宿主 生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的,此设 计和操作予了基因工程跨越天然物种屏障的能力,克服了固有的生物种间的限制,允许
并扩大了定向性创造新物种的可能性,这是基因工程的最大特点。 基因工程问世以来,其各种名称相继问世,在文献中常见的有遗传工程( genetic en gineering)、基因工程( gene engineering)、基因操作( gene manipulation)、重组DNA技 术( recombinant DNA technique)、分子克隆( molecular cloning)、基因克隆( gene clo- ning)等,这些术语所代表的具体内容彼此相关,在许多场合下被混同使用,难以严格区 分,不过它们之间还是存在一定的区别。 虽然上述概念针对的都是DNA,但是遗传工程、基因工程、DNA重组之间仍然存在 着一定程度的差别,这样的差别如下 a.遗传工程是发生在遗传过程中的自然界原本存在的导致变异的一种现象,即自然 出现的不同DNA链断裂,并连接成新的DNA分子,新的DNA分子含有不同于亲体的 DNA片段; b.DNA重组是人们根据遗传工程原理利用限制性内切酶在体外对DNA进行的人工 操作,即采用酶法,将来源不同的DNA进行体外切割与连接,构成杂种DNA分子,在 自然界一般不能自发实现; c·基因工程是遗传重组和DNA重组的目的和结果,无论是利用自然的(遗传重组) 还是人工的(DNA重组),最终目的是要实现基因重组。从操作对象是DNA来说,DNA 重组是本质和根本的。所以,DNA重组在广义上包括遗传重组和基因重组。 (2)基因工程的内容 基因工程包括以下主要内容。 a.带有目的基因的DNA片段的获取; b.在体外,将带有目的基因的DNA片段连接到载体上,形成重组DNA分子 c.重组DNA分子导入受体细胞(也称宿主细胞或寄主细胞); d.带有重组体的细胞扩增,获得大量的细胞繁殖群体; e.重组体的筛选 (3)基因工程操作的基本技术 基因工程的基本实验方法,除密度梯度超速离心、电子显微技术之外,还有DNA分 子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列结构分析和基因工程 的人工合成等多种新技术新方法 22.2基因工程在环境污染治理中的应用 在自然界中存在许多优良菌种,它们有效地分解自然界中的各种物质,但是随着现代 工业的不断发展,人工合成的非天然物质日益增多。例如,有机氯农药、有机磷农药、塑 料、合成洗涤剂等,不易被现存的微生物分解。上述物质在土壤和水中存留时间较长,丧 失75%~100%所需的时间快的要1周,慢的要几年甚至十几年,导致此类难降解物质在 土壤和水体中积累,严重污染环境,因此,在环境工程中极其霱要快速降解上述污染物的 高效菌,为此人们已在质粒育种和基因工程菌做了一些研究和试验,其中最成熟的、应用 最广泛的就是质粒育种技术。 (1)质粒育种 质粒在原核微生物中除有染色体外,还含有另一种较小的、携带少量遗传基因的环状 DNA分子,这段DNA被称为质粒,也叫染色体外DNA,它们在细胞分裂过程中能复 制,将遗传性状传给后代,有的质粒独立存在于细胞质中,也有的和染色体结合,形成附
加体。例如大肠杆菌的F因子(性因子) 目前所发现的质粒基因有:F因子(大肠杆菌性因子)、对某些药物表现抗性的R因 子、控制大肠杆菌素产生的Col因子、假单胞菌属中存在的降解某些具有特殊有机物降解 功能的质粒,如恶臭假单胞菌有分解樟脑的质粒、食油假单胞菌有分解正辛烷的质粒、恶 臭假单胞菌R1有分解水杨酸的质粒、铜绿色假单胞菌有分解萘的质粒等 质粒在原核微生物的生长中不像染色体邡样举足轻重,遵循严格的复制规律,常因某 种外界因素影响发生质粒的丢失或转移。某种细菌一日丧失质粒,就会丧失由该质粒决定 的某些性状,但菌体不死亡。质粒的另一个特点是可诱导产生,有些质粒,如F因子、R 因子能通过细胞与细胞的接触而转移,质粒从供体细胞转移到不含该质粒的受体细胞中 使受体细胞具有由该质粒决定的遗传性状。有的质粒可携带供体的一部分染色体基因一起 转移,从而使受体细胞既获得供体细胞质粒决定的遗传性状,又得到了供体细胞染色体决 定的某些遗传性状。 目前,科学上常常利用质粒的这些性状来培育优良菌种,同时质粒在基因工程中常被 用来作为基因转移的运载工具——载体。 (2)质粒育种举例 质粒育种是将两种或多种微生物通过细胞结合或融合技术,使供体菌的质粒转移到受 体菌体内,使受体菌保留自身功能质粒,同时获得供体菌的功能质粒,即培育出具有两种 功能质粒的新品种,这已在环境工程中获得初步研究成果,举例如下 ①多功能超级细菌的构建把降解芳烃、萜烃、多环芳烃的质粒转移到能降解脂烃 的假单胞菌体内,结果得到了同时降解4种烃类的“超级菌”,它能把原油中约2/3的烃 消耗掉,与自然菌种相比其降解速度快:自然菌种要花1年多才能将海上浮油分解完全, 而超级细菌只要几小时就分解完全。因此这种“超级细菌”对未来海上原油泄漏的处理是 十分有效的。但是必须注意在使用这种超级细菌的过程严格防止其泄漏到外界,防止其对 水环境中原有的土著菌产生毁灭性的打击。 ②解烷抗汞质粒菌的构建 Chakrabarty等人将嗜油假单胞菌体内含有的降解辛烷 乙烷、癸烷功能的OCT质粒和抗汞质粒MER同时转移到对20mg/1汞敏感的恶臭假单 胞菌体内,结果,这种敏感的恶臭假单胞菌可以抵抗50~70mg/L的汞,同时这种转化后 的菌可以高效分解辛烷 ③脱色工程菌的构建将分别含有降解偶氮染料质粒的编号K2和K两株假单胞菌 通过质粒转移技术培育出兼有分解两种偶氮染料功能的脱色工程菌 ④Q5T工程菌Q5T工程菌是将嗜温的 Pseudomonas puta pawl和嗜冷的Q5菌 株融合,使 Pseudomonas putida pawl体内降解甲苯、二甲苯的TOL质粒转移入Q5菌 株体内构建而成。该菌在0℃仍能正常利用浓度为1000mg/L的甲苯作碳源,这对寒冷地 区进行废水生物处理具有十分重要的意义 ⑤设计复合代谢途径硝基芳香族化合物,如炸药,即2,4,6-三硝基甲苯(TNT) 由于苯环上有强的吸电子基团(-NO2),因此难以进行好氧生物降解,有关TNT作为微 生物惟一碳源的报道极少,并且硝基脱除后形成的甲苯或其他芳香族衍生物难于被进一步 降解。但是最近有研究报道,分离出一株假单胞菌,可以利用TNT作为惟一氮源,但形 成的代谢产物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯不能被进一步降解,因为该微生物不能利用甲苯 作为碳源生长,因此将具有甲苯完整降解途径的TOL质粒导入该微生物体内,可以扩展
微生物的代谢能力和范围,构建的微生物可以利用TNT为惟一碳源和氮源生长。尽管 TNT能被这种复合降解途径所代谢,但由于硝基甲苯还原形成的氨苯仍然难以被降解, 因此还需要对该微生物进一步进行修饰,构建新的微生物以消除其硝酸盐还原反应,从而 使TNT完全降解 ⑥拓宽氧化酶的专一性许多有毒有害有机物,如芳香烃、多氯联苯(PCBs)、氯 代烃等,其最初的代谢反应大多由多组分氧合酶催化进行。这些关键酶的底物专一性阻碍 了一些有机物的代谢,如多氯联苯的异构体等。如何拓宽这些酶的底物范围,以有效降解 环境中的这类物质,是环境生物技术领域研究的一个重要方面。 对于多氯联苯联苯降解菌 Pseudomonas pseudoalcaligenes和甲苯苯降解菌 Pseudo monas putida F1,其最初双氧合酶编码基因的遗传结构、大小和同源性是相似的。然而 Pseudomonas pseudoalcaligenes不能氧化甲苯,而 Pseudomonas putida F1不能利用联苯 为碳源生长。将两种双氧合酶不同组分的编码基因“混合”,可以构建复合酶体系,以拓 宽其底物专一性,即构建新的工程菌。 将编码终端甲苯双氧合酶组分的基因todC和todC2导入 Pseudomonas pseudoal- caligenes可以构建重组茵株,使其能够氧化甲苯并利用其作为生长底物。甲苯双氧合酶活 性必需的组分铁氧化还原蛋白(FD)及其还原酶,显然可由宿主细胞中的联苯双氧合酶 组分提供。 用甲苯双氧合酶中的类似基因代替联苯双氧合酶中的终端铁硫蛋白的亚单元编码基 因,可以构建杂合多组分双氧合酶。这些新的杂合酶既可以氧化甲苯,又可以氧化联苯 由此可以看出,通过取代相关酶中的一些组分,可以改变其底物的专一性 三氯乙烯(TCE)是一类广泛存在且难以生物降解的有机污染物,某些氧合酶可以 进攻该分子,但是氧化速率通常很低。甲苯双氧合酶对TCE具有部分活性,但在催化过 程中易于失活。 Pseudomonas pseudoalcaligenes中天然的联苯双氧合酶不能氧化TCE, 但试验发现,构建的包含甲苯双氧合酶大氧合酶亚单元的杂合联苯双氧合酶体系可以氧化 TCE,并且其氧化速度为天然的联苯双氧合酶的3倍。如果复合酶在TCE的氧化过程中 比甲苯双氧合酶更稳定,那么利用这种方法构建的新的酶系统,将拓宽其底物专一性,在 环境污染的治理中大有作为。 拓宽联苯双氧合酶底物专一性范围的另一应用是降解多氯联苯,工业用PCBs的混合 物,如 Aroclors有60~80种同系物。处理受多氯联苯污染的土壤时,要求微生物能降解 绝大多数或所有的这些同系物 Bopp的实验表明, Pseudomonas sp.LB400中的联苯双氧合酶能氧化较广谱的PCBs 同系物,包括一些六氯代联苯,但对一些对位取代的间系物,如4,4-氯代联苯、2,4,4 氯代联苯、4,3,4氯代联苯的降解速度很慢。 Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707中 联苯双氧合酶对PCBs的作用范围较窄,但能降解对位取代的同系物。上述两种酶系统的 DNA完整序列已经知道,并且两者具有很高程度的序列同源性。这些联苯双氧合酶中的 两个组分是完全相同的,其他组分也显示出95%以上的等同性。 Erickson等人认为,将 Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707联苯双氧合酶的终端 组分中的氨基酸引人到 Pseudomonas sp.LB400双氧合酶终端组分中,可以增加后者酶对 对位取代的PCBs的降解活性。利用定位诱变,在LB400酶终端组分中改变4个氨基酸, 即将区域35到341中的 TFNNIRI改变成KF707中的 AINTIRT。当诱变质粒转入到
E.coli细胞后进行PCBs同系物专一性分析,结果发现新的酶对对位取代的PCBs具有降 解活性,并同时保留IB400联苯双氧合酶较广谱的底物范围。上述实验表明,可以通过 对关键酶类的基因改造来拓宽其对底物降解的专一性范围,从而达到治理环境污染的 日的 通过基因工程对某些特种细菌中酶系统的改造、更新,进而构建出人们理想中的工程 莤,以提高环境中某些特种有害有毒有机污染物的去除效率,经过基因工程重新构建的工 程菌无一不表现出了以下2个特点:(a)提高了微生物的降解速率,(b)拓宽了底物的专 显而易见,构建的工程菌比环境中土著菌有更强的适应能力,所以,在使用工程菌的 过程中,应特别小心,以防止这种工程菌进入环境,如果其作为外来物种侵入环境,无疑 将凭借其快速的物质利用性和广谱的底物利用范围成为优势种群,从雨使环境中的土著菌 将会消失,破坏当地的生态环境 2.3细胞工程及其在环境污染防治中的应用 微生物细胞工程是指应用微生物进行细胞水平的研究和生产,具体内容包括各种微生 物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等 ①微生物的培养包括不同微生物的营养要求以及各种微生物的培养方法。 ②遗传性状的改造改变微生物的遗传性状,主要是为了进行基础性遗传学研究或 选育高产菌株,前者属“遗传学”内容。进行微生物育种的途径很多,主要有物理或化学 诱变、DNA重组等。诱变育种将在“发酵工程”部分介绍。DNA重组技术已在“基因工 程”一节中有所论述。 ③微生物细胞的应用包括应用微生物细胞本身,如生产单细胞蛋白( single cell protein,sCP)或利用微生物细胞进行有用产物的生产。 近年来,生物技术发展迅猛,应用范围越来越广,由于技术操作与条件要求都比较简 单,因此微生物原生质体融合技术日益受到人们的重视。原生质体融合是进行细胞遗传重 组的最简便方法,其优点很多,特别是在不具有接合作用的菌株之间或对感受态尚不了解 的菌株,除去细胞壁之后,原生质体之间可以比较容易地进行细胞质融合,进而核融合。 通过DNA重组技术,携带外源DNA的载体,在适当的条件下可以进入受体细胞,如 pBR322可以较容易地进入大肠杆菌细胞中,但对链霉菌、酵母菌、丝状真菌,这种转化 是十分困难的。因此,如何消除细胞壁的原生质体是目前将重组DNA技术用于上述微生 物的关键环节。为使重组DNA技术成功,受体菌原生质体的形成与再生都是十分重 要的。 在原生质体融合的基本过程中,经培养获得大量菌体细胞,用脱壁酶处理脱壁,制成 原生质体。将两种不同菌株的原生质体混合在一起,使原生质体彼此接触、融合,使融合 的原生质体在合适的培养基平板上再生出细胞壁,并生长繁殖,形成菌落;最后测定参与 融合的性状重组或产量变化情况,以筛选出重组子。 2.3.1细胞工程概述 利用化学或物理的手段将游离的微生物细胞限定在一定的空间区域,并保持其活性以 进行污染物的降解,这就是固定化细胞的污水处理技术