8免疫化学技术 8.1免疫化学技术简介 现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反应的机制。此外,还研 究体内其他免疫活性物质,如补体分子的组成、结构及其功能。目前,免疫化学已应用于免 疫性疾病发病机制的基础研究和临床检测等, 随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展,免疫学实验技术也迅猛发展,并已成 为当今生命科学研究的重要手段,尤其是在医学基础研究和临床实践中得到广泛应用 免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。前者主要是根据抗原与相应抗体 能在体外发生特异性结合,并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶解等反应,从而 采用已知抗原检测未知抗体,或用已知抗体检测未知抗原。此外,尚包括检测体液中各种可 溶性免疫分子,诸如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等 细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞(T细胞、B细胞、K细胞、NK细胞及巨噬细胞等) 表面所具有的独特标志及其各自的特殊功能,在体外(有时亦可在体内)测定上述各种细胞 及其亚群的数量和功能,以帮助了解机体的细胞免疫水平。 本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的基本原理及实验操作方法 8.2抗原的免疫原性和专一性 抗原与兔疫原:抗原( antigen, Ag)是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应 答,并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质, 也称为免疫原( Immunogen)。前一种性能称为免疫原性( Immunogenicity)或抗原性 ( antigenicity),后一种性能称为反应原性( reactogenicity)或免疫反应性( Immunoreactivity) 抗原的分类:根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原( complete antigen)和半抗原 ( hapten)两类。同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原,如细菌、病毒、异 种动物血清等。仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性,而无免疫原性的物质 称为半抗原,如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质,它们本身不具免疫原性,但当 与蛋白质大分子结合后形成复合物,便获得了免疫原性,这种与半抗原结合并赋予它免疫原 性的蛋白质大分子称为载体( carrier)。根据抗原的来源不同可分为外源性抗原与内源性抗 原。外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的。内源性抗原是指体内的自身 成分,如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰,成为一 种自身抗原或称新生抗原,使机体发生免疫反应。而根据抗原的化学组成可分成蛋白质、糖 类、脂类与核酸等抗原
153 8 免疫化学技术 8.1 免疫化学技术简介 现代免疫化学是研究抗原与抗体的组成、结构以及抗原和抗体反应的机制。此外，还研 究体内其他免疫活性物质，如补体分子的组成、结构及其功能。目前，免疫化学已应用于免 疫性疾病发病机制的基础研究和临床检测等。 随着免疫化学、细胞生物学及分子生物学的进展，免疫学实验技术也迅猛发展，并已成 为当今生命科学研究的重要手段，尤其是在医学基础研究和临床实践中得到广泛应用。 免疫学检测方法可分为体液免疫测定及细胞免疫测定。前者主要是根据抗原与相应抗体 能在体外发生特异性结合，并在一些辅助因子的参与下出现沉淀、凝集及溶解等反应，从而 采用已知抗原检测未知抗体，或用已知抗体检测未知抗原。此外，尚包括检测体液中各种可 溶性免疫分子，诸如补体、各类免疫球蛋白、循环免疫复合物、溶菌酶、各种细胞因子等。 细胞免疫测定则是根据各种免疫细胞（T 细胞、B 细胞、K 细胞、NK 细胞及巨噬细胞等） 表面所具有的独特标志及其各自的特殊功能，在体外（有时亦可在体内）测定上述各种细胞 及其亚群的数量和功能，以帮助了解机体的细胞免疫水平。 本章节仅限于介绍几种主要的免疫化学实验技术的基本原理及实验操作方法。 8.2 抗原的免疫原性和专一性 抗原与免疫原：抗原（antigen,Ag）是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应 答，并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质， 也称为免疫原（immunogen）。前一种性能称为免疫原性（immunogenicity）或抗原性 （antigenicity），后一种性能称为反应原性（reactogenicity）或免疫反应性（immunoreactivity）。 抗原的分类：根据抗原物质所具备的性能可分为完全抗原（complete antigen）和半抗原 （hapten）两类。同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原，如细菌、病毒、异 种动物血清等。仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质 称为半抗原，如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当 与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性，这种与半抗原结合并赋予它免疫原 性的蛋白质大分子称为载体（carrier）。根据抗原的来源不同可分为外源性抗原与内源性抗 原。外源性抗原是从外界引入体内而刺激机体发生免疫应答的。内源性抗原是指体内的自身 成分，如机体的组织或细胞因理化因素作用或病毒感染使这些成分发生改变或修饰，成为一 种自身抗原或称新生抗原，使机体发生免疫反应。而根据抗原的化学组成可分成蛋白质、糖 类、脂类与核酸等抗原
构成免疫原的条件:异物性是抗原物质的首要性质。免疫活性细胞在正常情况下具有高 度精确的识别能力,能识别“自己”和“非己”,将非己物质加以排斥。免疫应答就其本质 来说,就是识别异物和排斥异物的应答,故激发免疫应答的抗原一般需要是异物,具有异物 性的物质可分为以下几种:1)异种物质:马血清、异种蛋白质、各种微生物及其代谢产物, 对人来说是异种物质,均为良好抗原。2)同种异体物质:高等动物同种不同个体之间,由 于遗传基因不同,其组织成分的化学结构也有差异。因此,同种异体物质也可以是抗原物质。 例如人类红细胞A、B、O血型物质和人类白细胞抗原( human leukocyte antigen, HLA)即 属此类。3)自身抗原:自身组织成分通常无抗原性,但在某些异常情况下,自身成分也可 成为抗原物质。 抗原一般为大分子物质,其分子量在10kD以上。在一定范围内,分子量越大,其抗原 性越强。分子量在5kD以下的肽类,一般无抗原性,分子量为5-10kD的肽类为弱抗原 抗原须是大分子物质的原因为:1)分子量越大,表面的抗原决定簇越多,而淋巴细胞要求 有一定数量的抗原决定簇的刺激才能活化。2)大分子胶体物质的化学结构稳定,不易被破 坏和清除,在体内停留时间较长,能持续刺激淋巴细胞 大分子物质并不一定都有抗原性。例如明胶是蛋白质,分子量达100kD以上,但其免 疫原性很弱。因明胶所含成分为直链氨基酸,不稳定,易在体内水解成低分子化合物。如在 明胶分子中加入少量酪氨酸则能增强其抗原性。因此,抗原物质除应为大分子外,其表面必 须有一定的化学组成和结构。此外,抗原分子的构象( conformation)即抗原分子中一些特 殊化学基因的三维结构,它决定该抗原分子是否能与相应淋巴细胞表面的抗原受体互相吻 合,从而启动免疫应答。抗原分子的构象变化,可导致其抗原性的改变。抗原的物理性状与 免疫原性的强弱有关。一般具有环状结构的蛋白质其抗原性比直链分子强:聚合状态的蛋白 质较其单体抗原性为强;颗粒性抗原较可溶性抗原为强。 具备上述性状的物质须经非消化道途径进入机体(包括注射、吸入、混入伤口等),并 接触免疫活性细胞,才能成为良好抗原。 抗原特异性的物质基础:抗原决定簇( antigenic determinant AD)是存在于抗原表面的 特殊基团,又称表位( epitope)。抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合, 从而激活淋巴细胞,引起免疫应答,抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合 因此,抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构,也是免疫反应具有特异性的物质基础。一个 抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇,每种决定簇只有一种抗原特异性。抗原决定 簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位。一般蛋白质的决定簇由5-6个氨基酸残基组成
154 构成免疫原的条件：异物性是抗原物质的首要性质。免疫活性细胞在正常情况下具有高 度精确的识别能力，能识别“自己”和“非己”，将非己物质加以排斥。免疫应答就其本质 来说，就是识别异物和排斥异物的应答，故激发免疫应答的抗原一般需要是异物，具有异物 性的物质可分为以下几种：1）异种物质：马血清、异种蛋白质、各种微生物及其代谢产物， 对人来说是异种物质，均为良好抗原。2）同种异体物质：高等动物同种不同个体之间，由 于遗传基因不同，其组织成分的化学结构也有差异。因此，同种异体物质也可以是抗原物质。 例如人类红细胞 A、B、O 血型物质和人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）即 属此类。3）自身抗原：自身组织成分通常无抗原性，但在某些异常情况下，自身成分也可 成为抗原物质。 抗原一般为大分子物质，其分子量在 10kD 以上。在一定范围内，分子量越大，其抗原 性越强。分子量在 5kD 以下的肽类，一般无抗原性，分子量为 5－10kD 的肽类为弱抗原。 抗原须是大分子物质的原因为：1）分子量越大，表面的抗原决定簇越多，而淋巴细胞要求 有一定数量的抗原决定簇的刺激才能活化。2）大分子胶体物质的化学结构稳定，不易被破 坏和清除，在体内停留时间较长，能持续刺激淋巴细胞。 大分子物质并不一定都有抗原性。例如明胶是蛋白质，分子量达 100kD 以上，但其免 疫原性很弱。因明胶所含成分为直链氨基酸，不稳定，易在体内水解成低分子化合物。如在 明胶分子中加入少量酪氨酸则能增强其抗原性。因此，抗原物质除应为大分子外，其表面必 须有一定的化学组成和结构。此外，抗原分子的构象（conformation）即抗原分子中一些特 殊化学基因的三维结构，它决定该抗原分子是否能与相应淋巴细胞表面的抗原受体互相吻 合，从而启动免疫应答。抗原分子的构象变化，可导致其抗原性的改变。抗原的物理性状与 免疫原性的强弱有关。一般具有环状结构的蛋白质其抗原性比直链分子强；聚合状态的蛋白 质较其单体抗原性为强；颗粒性抗原较可溶性抗原为强。 具备上述性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并 接触免疫活性细胞，才能成为良好抗原。 抗原特异性的物质基础：抗原决定簇（antigenic determinant, AD）是存在于抗原表面的 特殊基团，又称表位（epitope）。抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合， 从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。一个 抗原分子可具有一种或多种不同的抗原决定簇，每种决定簇只有一种抗原特异性。抗原决定 簇的大小相当于相应抗体的抗原结合部位。一般蛋白质的决定簇由 5－6 个氨基酸残基组成
一个多糖决定簇由5—7个葡萄糖残基组成,一个核酸半抗原的决定簇包含6-8个核苷酸。 抗原结合价( antigenic valence)指能与抗体分子结合的决定簇的总数,包括抗原表面功 能价及其内部非功能价。 8.3抗体的结构和功能 抗体是机体受抗原刺激后,由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异 性结合的球蛋白,因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白( Immunoglobulin)。在免疫应答 过程中,抗体主要由分化的B淋巴细胞产生,但有时也需要其他类型的细胞,如T淋巴细 胞和巨噬细胞的协同作用。抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中,对体液免疫应答起主 要作用。目前已发现的人免疫球蛋白有五类,分别为lgG、lgA、lgM、lgD和Ig。免疫球 蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性。 各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有四条多肽链组成的基本结构单位,即由两条重链 ( heavy chain,H链)和两条轻链( light chain.,L链)通过不同数目的二硫键结成Y形(见 图81)。在抗体分子的N端,不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的,此区为“多 变区”( variable region,Ⅴ区),它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。由于抗体多变区这 结构特点,决定了它对抗原分子“识别功能”的多样性:不同抗体分子的C端结构基本 恒定,称为“稳定区”( constant region,C区)。当抗原与抗体结合时,抗体分子发生变构效 应和集聚作用,使稳定区的某些部位暴露出来,并立即发生一系列免疫生理效应,如固定补 体,促进对抗原分子的吞噬、溶解和清除作用 图8-1IgG1的基本结构 The basic structure of igG1 variabie region 450 residues light chain (212 residues
155 一个多糖决定簇由 5－7 个葡萄糖残基组成，一个核酸半抗原的决定簇包含 6－8 个核苷酸。 抗原结合价（antigenic valence）指能与抗体分子结合的决定簇的总数，包括抗原表面功 能价及其内部非功能价。 8.3 抗体的结构和功能 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异 性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白（Immunoglobulin）。在免疫应答 过程中，抗体主要由分化的 B 淋巴细胞产生，但有时也需要其他类型的细胞，如 T 淋巴细 胞和巨噬细胞的协同作用。抗体主要分布在体内血清中或外分泌液中，对体液免疫应答起主 要作用。目前已发现的人免疫球蛋白有五类，分别为 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。免疫球 蛋白最显著的特点是与抗原特异性结合以及其分子的不均一性。 各种不同类别的免疫球蛋白分子都含有四条多肽链组成的基本结构单位，即由两条重链 （heavy chain, H 链）和两条轻链（light chain, L 链）通过不同数目的二硫键结成 Y 形（见 图 8-1）。在抗体分子的 N 端，不同抗体分子的氨基酸组成和顺序都是不同的，此区为“多 变区”（variable region, V 区），它是抗体分子与抗原决定簇的结合部位。由于抗体多变区这 一结构特点，决定了它对抗原分子“识别功能”的多样性；不同抗体分子的 C 端结构基本 恒定，称为“稳定区”（constant region, C 区）。当抗原与抗体结合时，抗体分子发生变构效 应和集聚作用，使稳定区的某些部位暴露出来，并立即发生一系列免疫生理效应，如固定补 体，促进对抗原分子的吞噬、溶解和清除作用。 图 8-1 IgG1 的基本结构
Fig 8-1. The N-terminal end of IgGl is characterized by sequence variability(V) in both the heavy and light chains, referred to as the VH and Vi regions respectively. The rest of the molecule has a relatively constant(C) structure. The constant portion of the light chain is armed the Cl region. The constant portion of the heavy chain is further divided into three structurally discrete regions: Chl, CH2 and ch3. These globular regions, which are stabilized by intrachain disulphide bonds, are referred to as 'domains'. The sites at which the antibody binds antigen are located in the variable domains. The hinge region is a segment of heavy chain between the CHI and CH2 domains. Flexibility in this area permits the two antigen-binding sites to operate independently. There is close pairing of the domains except in the Ch2 region. Carbohydrate moieties are attached to the Ch2 domains. 免疫球蛋白在血清自由电泳图谱中主要分布在r一球蛋白区域,因此以前有人把r一球 蛋白误认为就是抗体。其实r一球蛋白不全是抗体,而抗体也不全在r一球蛋白区域内(见 图8-2)。 8-2人血清免疫球蛋白的分布 Distribution of the major human immunoglobulins albumin electrophoretic mobility Fig8-2 Electrophoresis of human serum showing the distribution of the four major immunoglobulin classes. Serum proteins are separated according to their charges in an electric field, and classified as al, a2, B and y, depending on their mobility(lge class has a similar mobility to lgd but cannot be represented quantitatively because of its low level in serum. Igg exhibits most charge heterogeneity, the other classes having a more restricted mobility in the B and fa8
156 Fig 8-1. The N-terminal end of IgG1 is characterized by sequence variability(V) in both the heavy and light chains, referred to as the VH and VL regions respectively. The rest of the molecule has a relatively constant(C) structure. The constant portion of the light chain is termed the CL region. The constant portion of the heavy chain is further divided into three structurally discrete regions: CH1, CH2 and CH3. These globular regions, which are stabilized by intrachain disulphide bonds, are referred to as ‘domains’. The sites at which the antibody binds antigen are located in the variable domains. The hinge region is a segment of heavy chain between the CH1 and CH2 domains. Flexibility in this area permits the two antigen-binding sites to operate independently. There is close pairing of the domains except in the CH2 region. Carbohydrate moieties are attached to the CH2 domains. 免疫球蛋白在血清自由电泳图谱中主要分布在г－球蛋白区域，因此以前有人把г－球 蛋白误认为就是抗体。其实г－球蛋白不全是抗体，而抗体也不全在г－球蛋白区域内（见 图 8-2）。 图 8-2 人血清免疫球蛋白的分布 Fig8-2 Electrophoresis of human serum showing the distribution of the four major immunoglobulin classes. Serum proteins are separated according to their charges in an electric field, and classified as 1, and depending on their mobility. (IgE class has a similar mobility to IgD but cannot be represented quantitatively because of its low level in serum). IgG exhibits most charge heterogeneity, the other classes having a more restricted mobility in the and fa8
8.4抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应( serologic reaction),因抗体主要存在于血清中,试 验时一般都采用血清标本,故名。但抗原抗体反应亦常用于细胞免疫测定,如对淋巴细胞表 面分化抗原的鉴定。因此,血清学一词已被广义的抗原抗体反应所取代 抗原与抗体在体外结合时,可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种 反应,例如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。在此基础上进行改进,又衍生出许多快速 而灵敏的抗原抗体反应,例如从凝集反应衍生出间接凝集、反向间接凝集、凝集抑制试验、 协同凝集试验等;从沉淀反应结合电泳,衍生出兔疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。此 外,还有各种免疫标记技术,如免疫荧光、酶免疫测定、放射免疫、免疫电镜及发光免疫测 定等 抗原抗体结合具有高度特异性,即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发 生反应。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型,而抗体的特异性则取决 于抗体 Ig Fab段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体不是通过共价键,而 是通过很弱的短矩引力而结合,如范德华引力( Van der waal' s attraction force)、静电引力 ( electrostatic force)、氢键( hydrogen bond)及疏水性作用( hydrophobic effect)等。 范德华引力与两种相互作用的分子或原子间的距离七次方成反比(F2=1/d7),即两者 越靠近,此引力越大。这种引力能否最大限度地发挥作用,关键在于分子的空间构型。抗原 与抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用,它可增加两种分子结合在一起的倾向 形成特异性抗原抗体复合物。若一个分子在形态上有一个凹陷,它能准确地与另一分子突出 的基因互补,如同抗原一抗体、酶一底物系统的活性部位的相互作用,这种相互作用可产生 最强的 Van der Waal接触。 静电引力又称库仑引力( Coulumbic attraction force)发生在带有相反电荷的基团之间, 例如NH3与COO之间。这种结合力的强度与两个相互作用基团间的距离平方成反比(F2 1/d2)。若两个分子间有可能发生电荷转移的部位,该部位也可能产生静电引力 氢键可在共价键结合的氢原子间产生。氢原子可与一个带负电荷的原子共价结合,再与 另一个带负电荷原子的非共价电子相互作用,就形成了氢键。例如 O…H-0一 氢键较弱,键能的大小取决于方向,即氢键具有方向性。在抗原抗体反应中氨基或羧基
157 8.4 抗原抗体的结合 体外抗原抗体反应又称血清学反应（serologic reaction），因抗体主要存在于血清中，试 验时一般都采用血清标本，故名。但抗原抗体反应亦常用于细胞免疫测定，如对淋巴细胞表 面分化抗原的鉴定。因此，血清学一词已被广义的抗原抗体反应所取代。 抗原与抗体在体外结合时，可因抗原的物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种 反应，例如凝集、沉淀、补体结合及中和反应等。在此基础上进行改进，又衍生出许多快速 而灵敏的抗原抗体反应，例如从凝集反应衍生出间接凝集、反向间接凝集、凝集抑制试验、 协同凝集试验等；从沉淀反应结合电泳，衍生出免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳等。此 外，还有各种免疫标记技术，如免疫荧光、酶免疫测定、放射免疫、免疫电镜及发光免疫测 定等。 抗原抗体结合具有高度特异性，即一种抗原分子只能与由它刺激所产生的抗体结合而发 生反应。抗原的特异性取决于抗原决定簇的数目、性质和空间构型，而抗体的特异性则取决 于抗体 Ig Fab 段的可变区与相应抗原决定簇的结合能力。抗原与抗体不是通过共价键，而 是通过很弱的短矩引力而结合，如范德华引力（Van der waal’s attraction force）、静电引力 （electrostatic force）、氢键（hydrogen bond）及疏水性作用（hydrophobic effect）等。 范德华引力与两种相互作用的分子或原子间的距离七次方成反比（F2＝1 / d 7 )，即两者 越靠近，此引力越大。这种引力能否最大限度地发挥作用，关键在于分子的空间构型。抗原 与抗体分子的互补空间关系有助于该引力发挥作用，它可增加两种分子结合在一起的倾向， 形成特异性抗原抗体复合物。若一个分子在形态上有一个凹陷，它能准确地与另一分子突出 的基因互补，如同抗原―抗体、酶―底物系统的活性部位的相互作用，这种相互作用可产生 最强的 Van der Waal 接触。 静电引力又称库仑引力（Coulumbic attraction force）发生在带有相反电荷的基团之间， 例如 NH3 ＋与 COO－之间。这种结合力的强度与两个相互作用基团间的距离平方成反比（F2 ＝1 / d 2 )。若两个分子间有可能发生电荷转移的部位，该部位也可能产生静电引力。 氢键可在共价键结合的氢原子间产生。氢原子可与一个带负电荷的原子共价结合，再与 另一个带负电荷原子的非共价电子相互作用，就形成了氢键。例如： －O … H－O－ －O … H－N－ －N … H－N－ 氢键较弱，键能的大小取决于方向，即氢键具有方向性。在抗原抗体反应中氨基或羧基