洗脱水封片 实验结果 细胞核中的DNA呈鲜亮的紫红色反应,它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况,而且还可从颜色 反应的深浅,来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色,核仁通常为负反应:但在有些材料的细胞 质中,DNA也会出现阳性反应 作业 1.绘图表示 Feulgen反应的染色结果,并验交 Feulgen反应的永久切片1张 2.总结 Feulgen反应染色结果的影响因素 思考题 1. Feulgen反应的实验原理是什么? 答:DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从而显示 出DNA的分布。 2.在稀盐酸水解后,为什么要用亚硫酸水进行洗片? 答:亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸,从而可以将用schf剂染色时所残留的碱性品红反应 掉,以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料 附 I Feulgen方法应注意的几个问题: 1.对照切片的制做
11 ↓ 水洗脱水封片 实 验 结 果 细胞核中的 DNA 呈鲜亮的紫红色反应，它不但反应出 DNA 存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色 反应的深浅，来判断 DNA 的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为负反应；但在有些材料的细胞 质中，DNA 也会出现阳性反应。 作 业 1. 绘图表示 Feulgen 反应的染色结果, 并验交 Feulgen 反应的永久切片 1 张。 2. 总结 Feulgen 反应染色结果的影响因素。 思 考 题 1. Feulgen 反应的实验原理是什么？ 答：DNA 经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从而显示 出 DNA 的分布。 2. 在稀盐酸水解后，为什么要用亚硫酸水进行洗片？ 答：亚硫酸可与碱性品红反应生成品红亚硫酸，从而可以将用 schiff 剂染色时所残留的碱性品红反应 掉，以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料。 [ 附 ] Feulgen 方法应注意的几个问题： 1. 对照切片的制做
进行 Feulgen反应时,一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放 在schf剂内,且应为负反应。但需要注意的是,对照切片在schf试剂中最多不要超过1h (0.5h即可),时间过长,试剂本身的酸性也会使DNA水解,从而出现假的正反应 2.固定剂的选择 以前很多人认为,选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定 剂对反应的专一性并没有影响。实践证明,一切好的组织学固定剂均适用于 Feulgen反应。如 Champy固定剂、Hely固定剂、 Flemming固定剂、OsO4固定剂、 Carnoy固定剂、 zenker 固定剂和Boun-Aer固定剂 但在上述固定剂中,以OsO4和 Carnoy效果较好,OsO4(1%或0.5%)是 Feulgen反应的 理想固定剂,只是因OsO4价钱较贵,故一般多采用 Carnoy固定液。在 Feulgen反应中,不能 单独使用 Bouin定液,因为它是 Feulgen反应的最坏固定剂,但经Aler改进后的 Bou in-Aler 固定液效果却较好。 3.水解时间 Feulgen反应通常用稀酸进行水解,但水解的时间一定要适当。如水解时间不够,反应就会变 弱:如水解时间过长。或水解地过于剧烈,则脱氧核糖也易掉下来,反应也会减弱。适当的水解时 间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓 度而定 4. Schiff试剂的作用 Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素,就是 schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品 红,它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才 行。此外, Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应
12 进行 Feulgen 反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放 在 schif f 剂内，且应为负反应。但需要注意的是，对照切片在 schif f 试剂中最多不要超过 1 h (0.5 h 即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使 DNA 水解，从而出现假的正反应。 2. 固定剂的选择 以前很多人认为，选用的固定剂不应含有醛基或含有氧化剂。后来发现含醛基或氧化剂的固定 剂对反应的专一性并没有影响。实践证明，一切好的组织学固定剂均适用于 Feulgen 反应。如 Bhampy 固定剂、Helly 固定剂、Flemming 固定剂、OsO4 固定剂、Carnoy 固定剂、zenker 固定剂和 Bouin-Aller 固定剂。 但在上述固定剂中，以 OsO4 和 Carnoy 效果较好，OsO4(1%或 0.5%)是 Feulgen 反应的 理想固定剂，只是因 OsO4 价钱较贵，故一般多采用 Carnoy 固定液。在 Feulgen 反应中，不能 单独使用 Bouin 定液，因为它是 Feulgen 反应的最坏固定剂，但经 Aller 改进后的 Bouin-Aller 固定液效果却较好。 3. 水解时间 Feulgen 反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变 弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时 间一般为 8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓 度而定。 4. Schiff 试剂的作用 Feulgen 反应成功与否的一个非常关键的因素，就是 schiff 试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品 红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA 染色反应用”的碱性品红才 行。此外，Schiff 试剂的配制方法也可影响 DNA 的染色反应
实验三染色体的标本制作及其组型实验 长期以来,在真核生物中,染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据 之一。染色体作为遗传物质-DNA的载体,对生物的遗传、变异、进化和个体发生,以及细胞的增殖和生理过 程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细 胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置,以至带型有序地排列起来,此模式图象排列即为核型 ( karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准,对制作出的染色体标本进行照相以获得染色 体的显微图象,并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴( oe Hin Tjio)和瑞典学者 A Levan合作,利用低渗 法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法,终于在1956年首次确定了人类的染色体数目是46条,而不是前 人所主张的48条,这为后来的人类核型研究奠定了基础 实验目的 1.通过实验,初步掌握染色体标本的制做方法,进一步了解各操作步骤的原理 2.通过组型实验,掌握染色体组型的基本方法 实验原理 自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素( phytohemagglutinin,PHA)处理后处于分裂状态的组 织或细胞,均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中,精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织,可不经 PHA处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面,精巢又比骨髓要简易一些,故本实验选用小鼠的精巢为 实验材料。 对于小鼠精巢染色体标本的制作,一般包括以下几个要点:1.用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形 成,使细胞分裂停滞在中期,使中期染色体停留在赤道面处;2.用低渗法使将细胞膨胀,以至于在滴片时细胞 被胀破,使细胞的染色体铺展到载玻片上;3.空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平,经 Giemsa染 色后便可观察到染色体的显微图象 染色体组型又名核型,是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺 序和组次予以系统排列而成的模式图,它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以 下几个参数:1.相对长度( relative length):指单个染色体的长度与包括X染色体在内的单倍体染色体总长 度之比,相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X染色体)的总长度×100%。2.臂指数(arm ndex):指染色体长臂与短臂的比率,臂指数=长臂/短臂。3.着丝粒指数( centromere index):指短臂占 整个染色体长度的比率,着丝粒指数=短臂/整个染色体长度x100%,该比率决定了着丝粒在染色体中的相对 位置。4.染色体的臂数:对于端部着丝粒染色体,臂数为1,其它为2。根据 Levan(1964)所制定的人类染 色体标准,臂指数在1.0~1.7之间的染色体为中央着丝粒染色体,在1.7~3.0之间为亚中央着丝粒染色 体,在3.0~7.0间为亚端部着丝粒染色体,大于7.0为端部着丝粒染色体:着丝粒指数在50.0~37.5之间
13 实验三 染色体的标本制作及其组型实验 长期以来，在真核生物中, 染色体的数量和形态具有物种的特异性一直可以作为此物种分类的基本依据 之一。染色体作为遗传物质-DNA 的载体, 对生物的遗传、变异、进化和个体发生, 以及细胞的增殖和生理过 程的平衡控制等都具有十分重要的意义。每一个物种的细胞一般都有一定数目、形状和大小的染色体。将体细 胞核中全部染色体按照其大小、着丝粒位置，以至带型有序地排列起来，此模式图象排列即为核型 (karyotype)或染色体组型。核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色 体的显微图象，并将其剪裁排列即成。华裔学者庄有兴(Joe Hin Tjio)和瑞典学者 A.Levan 合作, 利用低渗 法研究胎儿肺组织的染色体标本制做方法，终于在 1956 年首次确定了人类的染色体数目是 46 条，而不是前 人所主张的 48 条，这为后来的人类核型研究奠定了基础。 实 验 目 的 1. 通过实验，初步掌握染色体标本的制做方法，进一步了解各操作步骤的原理 2. 通过组型实验，掌握染色体组型的基本方法 实 验 原 理 自身正处于活跃分裂状态或用植物血球凝集素(phytohemagglutinin, PHA)处理后处于分裂状态的组 织或细胞，均可用于染色体标本的制作与分析。在正常动物体中，精巢和骨髓均为是活跃分裂的组织，可不经 PHA 处理直接用来制作染色体标本。但在取材方面，精巢又比骨髓要简易一些，故本实验选用小鼠的精巢为 实验材料。 对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形 成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞 被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经 Giem sa 染 色后便可观察到染色体的显微图象。 染色体组型又名核型，是指根据染色体的长度、形态和着丝粒的位置将中期染色体依照所规定的标准顺 序和组次予以系统排列而成的模式图，它代表了一个个体或物种的染色体特征。进行染色体组型主要依据有以 下几个参数: 1. 相对长度(relative length): 指单个染色体的长度与包括 X 染色体在内的单倍体染色体总长 度之比，相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X 染色体)的总长度×100%。2. 臂指数(arm index): 指染色体长臂与短臂的比率，臂指数=长臂/短臂。3. 着丝粒指数(centromere index): 指短臂占 整个染色体长度的比率，着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%, 该比率决定了着丝粒在染色体中的相对 位置。4. 染色体的臂数: 对于端部着丝粒染色体，臂数为 1，其它为 2。根据 Levan(1964)所制定的人类染 色体标准，臂指数在 1.0~1.7 之间的染色体为中央着丝粒染色体，在 1.7~3.0 之间为亚中央着丝粒染色 体，在 3.0~7.0 间为亚端部着丝粒染色体，大于 7.0 为端部着丝粒染色体；着丝粒指数在 50.0~37.5 之间
的染色体为中央着丝粒染色体,在37.5~25.0之间为亚中央着丝粒染色体,在25.0~125之间为亚端部着 丝粒染色体,小于12.5为端部着丝粒染色体 实验用品 、材料小白鼠,蟾蜍 二、器材 普通离心机,恒温水浴,手术剪和手术镊各20把,100m量筒5个,滴管20支,10m小烧杯5 个,10m刻度离心管20支,试管架5个,染色用玻璃板5块,载、盖片各20片:显微镜20台,香柏油5 瓶,擦镜纸5本,直尺20把,复印的染色体标本图20页 试剂 1.秋水仙素:称取秋水仙素10mg加10ml的注射用水,即得0.1%的秋水仙素液,以此作为原液。在 使用时,需将原液稀释50倍,即取0.1m原液,加4.9m注射用水,稀释后秋水仙素的浓度为20蒲 2.生理盐水:哺乳动物及人类为0.9%的NaCI溶液,两栖类为0.7%的NaC溶液。 3. Carnoy"s固定液:甲醇:冰醋酸为3:1,必须现用现配 4. Giemsa染液的配制: 吉姆萨粉( Giemsa stain) 甘油(AR) 66m 甲醇(AR) 66ml 将 Giemsa粉放入硏钵中,先加入少量甘油,研磨至无颗粒为止,然后再将全部甘油倒入,放56℃温 箱中2h后,加入甲醇,将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。 5.磷酸缓冲液 1/15mo/ L NazHPO412HO:2.39g溶于100ml双蒸水中。 1/15 mol/L KH2P04 0.907g溶于100m双蒸水中。 取1/15 mol/L Na2HPO412HO液80ml、1/15 mol/L KH2PO4液20m混合即为pH=738之磷 酸缓冲液。 如用无水Na2HPO4配制磷酸缓冲液,还可用以下方法配制 A液 Na2HPO4
14 的染色体为中央着丝粒染色体，在 37.5~25.0 之间为亚中央着丝粒染色体，在 25.0~12.5 之间为亚端部着 丝粒染色体，小于 12.5 为端部着丝粒染色体。 实 验 用 品 一、材料 小白鼠，蟾蜍 二、器材 普通离心机，恒温水浴，手术剪和手术镊各 20 把，100ml 量筒 5 个，滴管 20 支，10ml 小烧杯 5 个，10ml 刻度离心管 20 支，试管架 5 个，染色用玻璃板 5 块, 载、盖片各 20 片；显微镜 20 台, 香柏油 5 瓶，擦镜纸 5 本，直尺 20 把，复印的染色体标本图 20 页。 三、试剂 1. 秋水仙素: 称取秋水仙素 10mg 加 10ml 的注射用水，即得 0.1%的秋水仙素液, 以此作为原液。在 使用时，需将原液稀释 50 倍，即取 0.1ml 原液，加 4.9ml 注射用水，稀释后秋水仙素的浓度为 20 蔳 /ml。 2. 生理盐水: 哺乳动物及人类为 0.9%的 NaCl 溶液，两栖类为 0.7%的 NaCl 溶液。 3. Carnoy"s 固定液；甲醇:冰醋酸为 3:1, 必须现用现配。 4. Giem sa 染液的配制； 吉姆萨粉(Giem sa stain) l.0g 甘油(AR) 66ml 甲醇(AR) 66ml 将 Giem sa 粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放 56℃温 箱中 2h 后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于 0~4℃保存)。 5. 磷酸缓冲液； 1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O: 2.39g 溶于 100ml 双蒸水中。 1/15 mol/L KH2PO4 0.907g 溶于 100ml 双蒸水中。 取 1/15 mol/L Na2HPO4·12H2O 液 80ml、1/15 mol/L KH2PO4液 20ml 混合即为 pH=7.38 之磷 酸缓冲液。 如用无水 Na2HPO4配制磷酸缓冲液，还可用以下方法配制； A 液: Na2HPO4 9.47g
双蒸水 1000m B液 KH2PO4 9.06g 双蒸水 1000m 根据下表中所示比例即可配制出不同pH值的磷酸缓冲液 表1磷酸缓冲液配制比例 66 37.5 500 38.9 74 80.4 6.0.3%KCI水溶液(低渗液) 实验方法 染色体标本的制做 取小白鼠注射秋水仙素 断头法杀死,取睾丸洗净血污 移入KC的低渗溶液内将睾丸剪碎(呈乳白色) ↓铜网过滤至刻度离心管中 加入KC低渗溶液于37℃水浴中低渗处理30min(使细胞膨胀) 800~1000r/min离心8min
15 双蒸水 1000ml B 液: KH2PO4 9.06g 双蒸水 1000ml 根据下表中所示比例即可配制出不同 pH 值的磷酸缓冲液。 表 1 磷酸缓冲液配制比例 pH 值 A 液(ml) B 液(ml) 5.8 7.8 92.2 6.0 12.0 88.0 6.4 26.5 73.5 6.6 37.5 62.5 6.8 50.0 50.0 7.0 61.1 38.9 7.2 71.5 28.5 7.4 80.4 19.6 6. 0.3% KCl 水溶液（低渗液）。 实 验 方 法 一、 染色体标本的制做 取小白鼠注射秋水仙素 ↓14~16h 后 断头法杀死，取睾丸洗净血污 ↓ 移入 KCl 的低渗溶液内将睾丸剪碎(呈乳白色) ↓铜网过滤至刻度离心管中 加入 KCl 低渗溶液于 37℃水浴中低渗处理 30min（使细胞膨胀） ↓ 800~1000r/min 离心 8min