↓轻轻地去除上清液 加入新配制的 Carnoy"s固定液,立即用吸管轻轻将细胞吹散 室温固定8min 800~1000r/min离心8min ↓弃去上清液 加入新制 Carnoy"s固定液,用滴管轻轻将细胞吹散,制成细胞悬液 取出预冷的干净载玻片,以10~15cm高度滴加细胞悬液(细胞胀破) 立即吹打载玻片 多余的水分吸去后用文火烤干或空气干燥 稀释 Giemsa原液 Giemsa染色(倒置染色法,后有说明)30min 用流水冲洗标本载玻片 火烤干显微观察 选择染色好的分裂相染色体封片后油镜下进行显微照相
16 ↓轻轻地去除上清液 加入新配制的 Carnoy"s 固定液，立即用吸管轻轻将细胞吹散 ↓ 室温固定 8min ↓ 800~1000r/min 离心 8min ↓弃去上清液 加入新制 Carnoy"s 固定液，用滴管轻轻将细胞吹散，制成细胞悬液 ↓ 取出预冷的干净载玻片，以 10~15cm 高度滴加细胞悬液（细胞胀破） ↓ 立即吹打载玻片 ↓ 多余的水分吸去后用文火烤干或空气干燥 ↓ 稀释 Giem sa 原液 Giem sa 染色（倒置染色法，后有说明）30min ↓ 用流水冲洗标本载玻片 ↓ 文火烤干显微观察 ↓ 选择染色好的分裂相染色体封片后油镜下进行显微照相
[附]:倒置染色法一一在玻璃板上用废旧载玻片作支架,使标本载玻片的标本面向下放置到支架上,在玻璃板 和标本载玻片之间滴加 Giemsa染液,目的一可以节省染料,二可以避免染液快速挥发,三可以防止染色颗 粒沉淀,影响观察。在操作时应注意,多个样品同时染色应摆放紧密,不要有间隙:滴染液时应尽量慢,不要 有气泡,以免部分染色体不被着色。 、染色体的组型实验 1.选择染色体清晰的照相底片,用放大机制作出放大10倍的清晰照片 2.将染色体逐一剪下,并对每个中期染色体逐一进行测量,包括每条染色体的长度和每个臂的长度。 3.根据测量数据,计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数 4.把相对长度与臂指数相近者配成一对。 参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值,并根据标准顺序,编排出染色体组型图 6.用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。 实验结果 在显微镜下,染色体被染成紫红色,胞浆完全不着色。对于分散好的染色体,其间相互散开,短臂收缩适 中,二条姐妹染色单体大致平行分离,着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为40条,多为端部和亚端部染色 体,只有2对亚中部着丝粒染色体 人类染色体为46条,可分为A、B、C、D、E、F、G七个群,其各自的基本特征见表2 表2人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征 类别包括染色体的序号 主要特征 A群第1~3对 体积大,中部着丝粒。第2对着丝粒略偏离中央 B群第4-5对 体积大,中部着丝粒。彼此间不易区分 中等大小,亚中部着丝粒。第6对的着丝粒靠近中央,X染色体大小介于第 C群第6-12对,X 6与7对之间,第9对的长臂上有一次缢痕,第11对的短臂较长,第12对的 短臂较短,彼此间不易区分 D群|第13~15对 中等大小,近端部着丝粒,有随体。彼此间不易区分 E群第16~18对 中等大小。第16对为中央着丝粒,长臂上有一次缢痕:第17、18对为亚 中央着丝粒,后者的短臂较短 F群第19-20对体积小,中部着丝粒。彼此间不易区分
17 [附]：倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架, 使标本载玻片的标本面向下放置到支架上, 在玻璃板 和标本载玻片之间滴加 Giem sa 染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗 粒沉淀，影响观察。在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量慢，不要 有气泡，以免部分染色体不被着色。 二、染色体的组型实验 1. 选择染色体清晰的照相底片，用放大机制作出放大 10 倍的清晰照片。 2. 将染色体逐一剪下，并对每个中期染色体逐一进行测量，包括每条染色体的长度和每个臂的长度。 3. 根据测量数据，计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。 4. 把相对长度与臂指数相近者配成一对。 5. 参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值，并根据标准顺序，编排出染色体组型图。 6. 用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。 实 验 结 果 在显微镜下，染色体被染成紫红色，胞浆完全不着色。对于分散好的染色体, 其间相互散开, 短臂收缩适 中, 二条姐妹染色单体大致平行分离, 着丝粒清晰可见。小鼠的染色体数为 40 条，多为端部和亚端部染色 体，只有 2 对亚中部着丝粒染色体。 人类染色体为 46 条，可分为 A、B、C、D、E、F、G 七个群，其各自的基本特征见表 2。 表 2 人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征 类别 包括染色体的序号 主 要 特 征 A 群 第 1~3 对 体积大，中部着丝粒。第 2对着丝粒略偏离中央 B群 第 4~5 对 体积大，中部着丝粒。彼此间不易区分 C群 第 6~12 对，X 中等大小, 亚中部着丝粒。第 6 对的着丝粒靠近中央, X 染色体大小介于第 6 与 7对之间, 第 9对的长臂上有一次缢痕, 第 11 对的短臂较长, 第 12 对的 短臂较短, 彼此间不易区分 D 群 第 13~15 对 中等大小，近端部着丝粒，有随体。彼此间不易区分 E群 第 16~18 对 中等大小。第 16对为中央着丝粒，长臂上有一次缢痕；第 17、18 对为亚 中央着丝粒，后者的短臂较短 F 群 第 19~20 对 体积小，中部着丝粒。彼此间不易区分
G群|第21~22对,Y 第21、22对体积小,近端着丝粒,有随体,长臂常呈分叉状:Y染色体较前 者略大,近端着丝粒,无随体,长臂常彼此平行 作业 1.通过对自己制做的小鼠染色体标本观察,总结小鼠染色体的形态特征。 2.对于分散好的染色体,进行染色体计数。 3.对于呈非整倍性的染色体标本,分析其形成原因。 4.认真做好小鼠的染色体组型图。 思考题 1.请你分析一下在本实验中造成染色体标本制做不佳的原因有哪些? 答:1秋水仙素用量太多或处理时间过长,会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解,最终会引起染色体 形态不正常,甚至被破坏或溶解 2低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度,细胞会破裂:低渗不足则染 色体在一起,分散不开。 3离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长,则会引起细胞破裂:反之,离心速度过 小或离心时间过短,则细胞沉降不下来,则会引起大量细胞的丢失 4固定液要随用随配,固定彻底后再打散细胞团块,否则细胞容易破碎,染色体分散亦受到影响 5载玻片有油脂或冷却不够,则会影响染色体的附着和铺展。 6用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔,用力过大则会造成细胞破裂,而染色体也会弥散在溶液中 随后的离心中将会丢失 7滴片时的高度很重要,高度过低细胞不会破裂:过高则染色体过于分散甚至丢失,无法辨别出染色体 的准确数量
18 G 群 第 21~22 对，Y 第 21、22 对体积小, 近端着丝粒, 有随体, 长臂常呈分叉状；Y 染色体较前 者略大, 近端着丝粒, 无随体, 长臂常彼此平行 作 业 1. 通过对自己制做的小鼠染色体标本观察，总结小鼠染色体的形态特征。 2. 对于分散好的染色体，进行染色体计数。 3. 对于呈非整倍性的染色体标本，分析其形成原因。 4. 认真做好小鼠的染色体组型图。 思 考 题 1. 请你分析一下在本实验中造成染色体标本制做不佳的原因有哪些？ 答：1 秋水仙素用量太多或处理时间过长，会导致染色体的过分凝缩或着丝点裂解，最终会引起染色体 形态不正常，甚至被破坏或溶解。 2 低渗处理不好。低渗液的量、处理时间均与细胞的数量有关。低渗过度，细胞会破裂；低渗不足则染 色体在一起，分散不开。 3 离心速度或离心时间的影响。离心速度过大或离心时间过长，则会引起细胞破裂；反之，离心速度过 小或离心时间过短，则细胞沉降不下来，则会引起大量细胞的丢失。 4 固定液要随用随配，固定彻底后再打散细胞团块，否则细胞容易破碎，染色体分散亦受到影响。 5 载玻片有油脂或冷却不够，则会影响染色体的附着和铺展。 6 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔，用力过大则会造成细胞破裂，而染色体也会弥散在溶液中，在 随后的离心中将会丢失。 7 滴片时的高度很重要，高度过低细胞不会破裂；过高则染色体过于分散甚至丢失，无法辨别出染色体 的准确数量
2.本实验中,对由小鼠精巢而来的染色体标本进行镜检时,发现染色体数有的为40条,而有的则为20 条,为什么?拥有20条染色体的单倍体细胞会是什么细胞? 答:有40条染色体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞、精母细胞。有20条染色体的可能是己完成第 次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现40条和20条染色体,是因为精巢里存在大量正在进行有丝 分裂和减数分裂的细胞,用秋水仙素处理后,所有细胞均停止分裂 3.从一般意义上讲,染色体标本制做的四大要点是什么? 答:A、植物血球凝集素(PHA)处理获得活跃分裂的细胞 B、秋水仙素处理可使细胞分裂停止在中期 C、低渗处理可使染色体分散: D、空气干燥法可使染色体平铺在载玻片上
19 2. 本实验中，对由小鼠精巢而来的染色体标本进行镜检时, 发现染色体数有的为 40 条，而有的则为 20 条，为什么？拥有 20 条染色体的单倍体细胞会是什么细胞？ 答：有 40 条染色体的可能是小鼠的体细胞、精原细胞、精母细胞。有 20 条染色体的可能是已完成第 一次减数分裂的精细胞或精子。之所以同时出现 40 条和 20 条染色体，是因为精巢里存在大量正在进行有丝 分裂和减数分裂的细胞，用秋水仙素处理后，所有细胞均停止分裂。 3. 从一般意义上讲，染色体标本制做的四大要点是什么？ 答：A、植物血球凝集素（PHA）处理获得活跃分裂的细胞； B、秋水仙素处理可使细胞分裂停止在中期； C、低渗处理可使染色体分散； D、空气干燥法可使染色体平铺在载玻片上
实验四染色体G带的分带技术 60年代以来,染色体分带技术有了突飞猛进的发展,特别是1970年以来,许多人类染色体分带技术的 出现在细胞遗传学的科学研究中开创了一个新的时期。染色体分带技术可使我们准确无误地识别每一条染色 体,使人们准确的认识每一个染色体和它们所发生的畸变,这就为染色体遗传疾病的诊断、杂种细胞检定,特 殊细胞株的标记、染色体的识别等开创了一种新的方法,有助于染色体研究的发展,在临床上有着重要意义 染色体分带技术最早(1968年)开始于瑞典科学家 Caspersson及他的同事的开拓性工作,他们用氮芥 喹丫因使染色体不同部位分化染色,显示出清晰的带纹。1971年, Pardue等又提出了吉姆萨( Giemsa)显 带技术。在前人研究的基础上,人们引用不同的物理、化学方法处理染色体标本,并用一定的染料染色,可使 每条染色体上出现明暗相间或深浅不同的带纹,称为染色体带。根据染色方法的不同可分为Q、G、C、R N、T及Cd等几种类型的 倍韵源斫辛颂教帧1臼笛橹氐憬樯茉诙锵赴旧逯谐S玫?span ang="EN-Us"stye="font- fam ily:" Times new roman">G-小带产生的机理及方法。 实验目的 1.学习染色体的G带显示方法 2.了解G-带染色体在细胞遗传学分析中的重要意义 实验原理 关于G带形成的机理,到目前为止还没有完全定论,但有人提出了以蛋白质构象改变为基础的显带机 理。此机理认为,带纹所反映的是蛋白质结构的差异,这种差异与DNA的功能活动相适应。G-带的形成与 Giemsa染料的组成及染色特性分不开。 Giemsa染料是由亚甲蓝(美蓝)、天蓝和曙红组成的复合染料,除曙 红外,均为噻臻类染料,它只与DNA中的PO43-基结合而不与蛋白质结合,所以染色体着色首先是两个噻 臻分子与DNA的结合,在此基础上结合一个曙红分子:形成2:1噻臻-曙红沉淀物。其次要有一个有助于染 料沉淀物积累的疏水环境。染色体上含有高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻臻-曙红沉淀物的形成,这些区域 相当于含高比例二硫键的氧化态蛋白质区域,经一系列处理后显示暗带,而另一些区域(明带区)则为含疏基的 还原态蛋白质,为亲水性蛋白质,对染料亲合力低,所以不显色。这表明,在G-带形成的过程中,蛋白质状 态是一个主要因素。这与染色体的功能有关。如果染色体上某一区域的DNA为重复序列,转录活性低,相应 地包装它们的蛋白质也较稳定,可能通过较强的二硫键形成很稳定的疏水的α-螺旋结构,成为染料沉淀物积 累的环境,从而显示出阳带(暗带)。反之,如果染色体上某一区域的DNA富含具转录活性的结构基因,则功 能上相对活跃,包装它们的蛋白质也较疏松,构象上类似β-折叠结构,经处理后二硫键断裂,还原为巯基 成为亲水性蛋白,不利于染料沉淀物的积累,所以着色浅,显示阴带(明带)。关于G-带形成的机理还有待进 步探讨。G-带有许多优点:染色是永久性的,以较长时间保存:带纹分析通常较好:用普通光学显微镜可 观察等
20 实验四 染色体 G-带的分带技术 60 年代以来，染色体分带技术有了突飞猛进的发展，特别是 1970 年以来，许多人类染色体分带技术的 出现在细胞遗传学的科学研究中开创了一个新的时期。染色体分带技术可使我们准确无误地识别每一条染色 体，使人们准确的认识每一个染色体和它们所发生的畸变，这就为染色体遗传疾病的诊断、杂种细胞检定，特 殊细胞株的标记、染色体的识别等开创了一种新的方法，有助于染色体研究的发展，在临床上有着重要意义。 染色体分带技术最早(1968 年)开始于瑞典科学家 Caspersson 及他的同事的开拓性工作，他们用氮芥 喹丫因使染色体不同部位分化染色，显示出清晰的带纹。1971 年，Pardue 等又提出了吉姆萨(Giem sa)显 带技术。在前人研究的基础上，人们引用不同的物理、化学方法处理染色体标本，并用一定的染料染色，可使 每条染色体上出现明暗相间或深浅不同的带纹，称为染色体带。根据染色方法的不同可分为 Q、G、C、R、 N、T 及 Cd 等几种类型的 倍韵源 斫 辛颂教帧１臼笛橹氐憬樯茉诙 锵赴 旧 逯谐Ｓ玫?span lang="EN-US" style="font-family:"Times New Roman"">G-小带产生的机理及方法。 实 验 目 的 1. 学习染色体的 G-带显示方法； 2. 了解 G-带染色体在细胞遗传学分析中的重要意义。 实 验 原 理 关于 G-带形成的机理，到目前为止还没有完全定论，但有人提出了以蛋白质构象改变为基础的显带机 理。此机理认为，带纹所反映的是蛋白质结构的差异，这种差异与 DNA 的功能活动相适应。G-带的形成与 Giem sa 染料的组成及染色特性分不开。Giemsa 染料是由亚甲蓝(美蓝)、天蓝和曙红组成的复合染料，除曙 红外，均为噻臻类染料，它只与 DNA 中的 PO43-基结合而不与蛋白质结合，所以染色体着色首先是两个噻 臻分子与 DNA 的结合，在此基础上结合一个曙红分子；形成 2:1 噻臻-曙红沉淀物。其次要有一个有助于染 料沉淀物积累的疏水环境。染色体上含有高浓度疏水性蛋白的区域有利于噻臻-曙红沉淀物的形成，这些区域 相当于含高比例二硫键的氧化态蛋白质区域，经一系列处理后显示暗带，而另一些区域(明带区)则为含疏基的 还原态蛋白质，为亲水性蛋白质，对染料亲合力低，所以不显色。这表明，在 G-带形成的过程中，蛋白质状 态是一个主要因素。这与染色体的功能有关。如果染色体上某一区域的 DNA 为重复序列，转录活性低，相应 地包装它们的蛋白质也较稳定，可能通过较强的二硫键形成很稳定的疏水的-螺旋结构，成为染料沉淀物积 累的环境，从而显示出阳带(暗带)。反之，如果染色体上某一区域的 DNA 富含具转录活性的结构基因，则功 能上相对活跃，包装它们的蛋白质也较疏松，构象上类似-折叠结构，经处理后二硫键断裂，还原为巯基， 成为亲水性蛋白，不利于染料沉淀物的积累，所以着色浅，显示阴带(明带)。关于 G-带形成的机理还有待进 一步探讨。G-带有许多优点: 染色是永久性的，以较长时间保存；带纹分析通常较好；用普通光学显微镜可 观察等