学生参观分两组交叉进行,一组参观透射电镜,一组参观扫描电镜,然后再交换参观内容。 2.电镜照片的展示 挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片,供同学们观察和学习,以了解各种亚细胞 构的超微结构特征 作业 1.通过本实验的学习,比较光镜与电镜工作原理的区别。 2.区分细胞的超微结构和显微结构,写出各种示教细胞器的名称及其结构特征。 思考题 1.通过本实验的学习,比较光镜与电镜的主要异同点。 答:电子显微镜与光学显微镜的主要异同点 光学显微镜 电子显微镜 照射光 波长(m)长:200750 短:0.003-0.008 质 光学透镜 电磁透镜 分辨力 0.2-0.lp 0.1nn 放大倍数 1,000 1,000,000 聚焦方式 机械聚焦 电聚焦 反衬度 吸收、反射散射、吸收、衍射、相位 2.总结扫描电镜与透射电镜的主要异同点 答:常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型,应用非 常广泛,既可以用来分析生物组织的内部结构,又可以用来研究金属内部的晶体结构;是当今世界上所用电镜 中数量最多的一类,约占现有电镜总数的90%左右,扫描电镜属于物体发射电子这一类,可以用来观察复杂的 表面图像,其焦深和分辨率不但比光镜高出很多,而且还能显示出样品表面的立体形象 [附]扫描电镜的结构与成像原理
6 学生参观分两组交叉进行，一组参观透射电镜，一组参观扫描电镜，然后再交换参观内容。 2. 电镜照片的展示 挑选一批具有代表性的动植物细胞不同超微结构的电镜照片，供同学们观察和学习，以了解各种亚细胞 结构的超微结构特征。 作 业 1. 通过本实验的学习，比较光镜与电镜工作原理的区别。 2. 区分细胞的超微结构和显微结构, 写出各种示教细胞器的名称及其结构特征。 思 考 题 1. 通过本实验的学习，比较光镜与电镜的主要异同点。 答： 电子显微镜与光学显微镜的主要异同点 光学显微镜 电子显微镜 照 射 光 光 束 电子束 波长(nm) 长：200~750 短：0.003~0.008 介 质 空 气 真 空 透 镜 光学透镜 电磁透镜 分 辨 力 0.2~0.1m 0.1nm 放大倍数 1,000 1,000,000 聚焦方式 机械聚焦 电聚焦 反 衬 度 吸收、反射 散射、吸收、衍射、相位 2. 总结扫描电镜与透射电镜的主要异同点。 答：常用的电镜可分为透射电镜和扫描电镜两大类。透射电镜便属于物体透射电子的一种类型，应用非 常广泛，既可以用来分析生物组织的内部结构，又可以用来研究金属内部的晶体结构; 是当今世界上所用电镜 中数量最多的一类, 约占现有电镜总数的 90%左右, 扫描电镜属于物体发射电子这一类, 可以用来观察复杂的 表面图像, 其焦深和分辨率不但比光镜高出很多，而且还能显示出样品表面的立体形象。 [ 附 ] 扫描电镜的结构与成像原理
在 Oatley等学者的努力下,于1965年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜( scanning electron microscope,SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发射出的次级电子,由带样 电荷的栅极收集后,即向电子显象管发送信号,在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形 象,反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面发射出次级电子,标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水 后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号,可用于电子成像 1扫描电镜的基本结构 扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理及显示系统,以 及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中,电子枪、电磁透镜、扫描线圈又被称为电子光学系统 其电子枪所发射电子的波长一般为1~10nm,使用的电压范围为1~10KV。扫描线圈为扫描电镜所特有的 结构,可作光栅状扫描,以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样品室较大,样品有专用的样品托,可 在样品室内进行各不同方向的平移和倾转:另外,在样品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系 统包括次级电子探测器、光电倍增管和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成,主要作用是收集由 标本表面发射出的次级电子,并将其转变成光子:光电倍增管可将光子信号放大后,又将其转换成电压信号 而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像。 2.扫描电镜的成像原理 电子枪发射出的电子束,经电磁透镜会聚成极细的电子束,并进而聚焦在待测样品表面:由于样品各不 同部位的表面形貌不同,入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用后所产生的次级电子信号也不 同;此次级电子信号为探测器接受后,被转变成光子,传递给光电倍增管进行放大和转换;转换成的电压信号 经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏上。 由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描,再加上显象管的偏转线圈电流与扫描线圈电流高度同 步,因此,显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的次级电子数均是一一对应的,因 此,显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。 综上所述,扫描电镜在结构和工作原理上均不同于透射电镜。如(1)扫描电镜所用样品的制备 方法简便,不需经过超薄切片,经固定、干燥和喷金后即可:(2)扫描电镜采用的是次级电子成 像;(3)扫描电镜所观察到图像景深长,图像富有立体感,但只能反映出样品的表面形貌,(4)图像 的放大倍率在很大范围内是连续可变的(101~105×)(5)样品的辐射损伤及污染程度小等。但与 透射电镜相比,扫描电镜又存在有其不可逾越的局限性,如(1)分辨率还不够高,(2)无法显示样 品内部的详细结构等。为此,近年来出现了一种新的电镜技术冰冻蚀刻技术( freeze etching), 利用“复膜( (replica)”在透射电镜下进行观察,既可观察到样品的内部结构,又可观察到富有立 体感的图像,还提高了分辨率
7 在 Oatley 等学者的努力下，于 1965 年研制成功了世界上第一台实用扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)商品。其功能是用来观察标本的表面形态结构。它将标本表面上发射出的次级电子，由带样 电荷的栅极收集后, 即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形 象，反映了标本表面的真实结构。为了使标本表面发射出次级电子，标本要进行特殊处理。标本在固定、脱水 后，要喷涂上一层重金属微粒, 重金属在电子束的轰击下会发出次级电子信号, 可用于电子成像。 1. 扫描电镜的基本结构 扫描电镜在结构上主要是由电子枪、电磁透镜、扫描线圈、样品室、信号的收集、处理及显示系统，以 及真空系统和供电保护系统等部分组成。其中, 电子枪、电磁透镜、扫描线圈又被称为电子光学系统。 其电子枪所发射电子的波长一般为 1~10nm，使用的电压范围为 1~10KV。扫描线圈为扫描电镜所特有的 结构，可作光栅状扫描，以便在荧光屏上显示出扫描图像。扫描电镜的样品室较大，样品有专用的样品托，可 在样品室内进行各不同方向的平移和倾转；另外，在样品室内还装配有检测部件。信号的收集、处理及显示系 统包括次级电子探测器、光电倍增管和显象管。次级电子探测器又由闪烁体和光导管构成，主要作用是收集由 标本表面发射出的次级电子，并将其转变成光子；光电倍增管可将光子信号放大后，又将其转换成电压信号； 而显象管便便可将所接受到的电压信号转变成为亮度不同的图像。 2. 扫描电镜的成像原理 电子枪发射出的电子束，经电磁透镜会聚成极细的电子束，并进而聚焦在待测样品表面；由于样品各不 同部位的表面形貌不同，入射电子束与样品表面所喷涂的重金属原子相互作用后所产生的次级电子信号也不 同; 此次级电子信号为探测器接受后, 被转变成光子，传递给光电倍增管进行放大和转换；转换成的电压信号 经扫描线圈扫描后显示在显象管的荧光屏上。 由于扫描线圈在样品上作扫描光栅状的逐点扫描，再加上显象管的偏转线圈电流与扫描线圈电流高度同 步，因此，显象管荧光屏上的任何一点的亮度与样品表面上相应点所发出的次级电子数均是一一对应的，因 此，显示在荧光屏上的图像就是样品表面形貌的真实写照。 综上所述，扫描电镜在结构和工作原理上均不同于透射电镜。如(1)扫描电镜所用样品的制备 方法简便, 不需经过超薄切片，经固定、干燥和喷金后即可；(2)扫描电镜采用的是次级电子成 像; (3)扫描电镜所观察到图像景深长, 图像富有立体感, 但只能反映出样品的表面形貌; (4)图像 的放大倍率在很大范围内是连续可变的(101~105×);(5)样品的辐射损伤及污染程度小等。但与 透射电镜相比，扫描电镜又存在有其不可逾越的局限性，如(1)分辨率还不够高; (2)无法显示样 品内部的详细结构等。为此，近年来出现了一种新的电镜技术-冰冻蚀刻技术(freeze etching)， 利用“复膜(replica)”在透射电镜下进行观察, 既可观察到样品的内部结构, 又可观察到富有立 体感的图像, 还提高了分辨率
实验二孚尔根反应( Feulgen reaction) Feulgen反应( Feulgen reaction)是显示DNA的最典型的组织化学反应,为学者 Feulgen和 Rossenbeck于1924年发明,简称为 Feulgen法。因对DNA的显示反应具有高度专一性,故常被用来显 示细胞内DNA的分布情况 实验目的 1.熟悉并掌握 Feulgen反应的原理及其实验操作方法 2.对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识 实验原理 自 Feulgen等发明该显示DNA的 Feulgen反应法以来,其作用机制也久经研究和讨论,现已取得一致 意见。其具体反应原理是,标本经稀盐酸水解后,DNA分子中的嘌呤碱基被解离,从而在核糖的一端岀现了 醛基。 Schiff试剂中的无色品红可与醛基反应,形成含有醌基的化合物分子,因醌基为发色团,故可呈现出紫 红色。也就是说,DNA经稀酸水解后产生的醛基,具有还原作用,可与无色品红结合形成紫红色化合物,从 而显示出DNA的分布。其反应机制如下图所示 2HCI+Na2S205-2NaCl+SO2+H2SO3 实验用品 、器材显微镜20台、立式染色缸80个、水浴锅1台 二、材料香柏油5瓶,擦镜纸5本,镊子5把,盖玻片20片,用 carnoy"s固定液固定的肝脏 和精巢切片20片
8 实验二 孚尔根反应（Feulgen Reaction） Feulgen 反应(Feulgen reaction)是显示 DNA 的最典型的组织化学反应，为学者 Feulgen 和 Rossenbeck 于 1924 年发明，简称为 Feulgen 法。因对 DNA 的显示反应具有高度专一性，故常被用来显 示细胞内 DNA 的分布情况。 实 验 目 的 1. 熟悉并掌握 Feulgen 反应的原理及其实验操作方法 2. 对细胞的免疫组化研究方法有一初步的认识 实 验 原 理 自 Feulgen 等发明该显示 DNA 的 Feulgen 反应法以来，其作用机制也久经研究和讨论，现已取得一致 意见。其具体反应原理是，标本经稀盐酸水解后，DNA 分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了 醛基。Schiff 试剂中的无色品红可与醛基反应，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基为发色团，故可呈现出紫 红色。也就是说, DNA 经稀酸水解后产生的醛基，具有还原作用，可与无色品红结合形成紫红色化合物，从 而显示出 DNA 的分布。其反应机制如下图所示。 2HCl+Na2S2O5→2NaCl+SO2+H2SO3 实 验 用 品 一、器材 显微镜 20 台、立式染色缸 80 个、水浴锅 1 台。 二、材料 香柏油 5 瓶，擦镜纸 5 本，镊子 5 把，盖玻片 20 片，用 carnoy"s 固定液固定的肝脏 和精巢切片 20 片
试剂 1.schi仟氏试剂将0.5g碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中,时时摇动玻璃瓶,煮沸5min使 之充分溶解,冷却至50℃时过滤,加入10m1mo/LHC,冷至25℃时,加入0.5g偏重亚硫酸钠 (Na2s203)无水亚硫酸钠( NaSo3),在室温冷暗处至少放置24h(有时需2~3天),使其颜色退至淡黄 色,密封瓶口,藏于暗处,最好保存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入0.5g活性碳,摇 1min,用粗滤纸过滤,滤液应为无色:若液体颜色变为粉红色,便不能再用 2.亚硫酸水(洗涤剂)用20om普通自来水(不要用蒸馏水,以免引起误差)、10m10%的偏重亚硫 酸钠水溶液和1oml1 mol/L HCI,三者在使用前混合,现用现配。 3.1mo/LHa(水解用)取825ml比重为1.19的盐酸加蒸馏水1000ml即成(应将盐酸缓缓加入 水中) 4.1%亮绿( light green)亮绿1g,溶于100ml蒸馏水中。 5.30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。 实验方法 Carnoy液固定 95%酒精(2次)每次20-30min 100%酒精2次(30min,40min 苯透明 石腊包埋 切片贴片 甲苯I(20min) 二甲苯I(10min) 100%酒精5min
9 三、试剂 1. schiff 氏试剂 将 0.5g 碱性品红置入三角烧瓶内沸腾的蒸馏水中，时时摇动玻璃瓶，煮沸 5min 使 之充分溶解，冷却至 50℃时过滤，加入 10ml 1mol/L HCl，冷至 25℃时，加入 0.5g 偏重亚硫酸钠 (Na2S2O3)无水亚硫酸钠(NaHSO3)，在室温冷暗处至少放置 24h(有时需 2~3 天)，使其颜色退至淡黄 色，密封瓶口，藏于暗处，最好保存于 4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。在使用前加入 0.5g 活性碳, 摇 1min, 用粗滤纸过滤，滤液应为无色；若液体颜色变为粉红色，便不能再用。 2. 亚硫酸水(洗涤剂) 用 200ml 普通自来水(不要用蒸馏水, 以免引起误差)、10ml 10%的偏重亚硫 酸钠水溶液和 10ml 1mol/L HCl，三者在使用前混合，现用现配。 3. 1mol/L HCl(水解用) 取 82.5ml 比重为 1.19 的盐酸加蒸馏水 1000ml 即成(应将盐酸缓缓加入 水中)。 4. 1%亮绿(light green) 亮绿 1g，溶于 100ml 蒸馏水中。 5. 30%、50%、70%、85%、95%、100%的梯度酒精及二甲苯。 实 验 方 法 Carnoy 液固定 ↓ 95%酒精（2 次）每次 20-30min ↓ 100%酒精 2 次(30 min, 40 min) ↓ 二甲苯透明 ↓ 石腊包埋 ↓ 切片贴片 ↓ 二甲苯 I(20 min) ↓ 二甲苯 II(10 min) ↓ 100%酒精 5min
95%酒精5min 85%酒精5min 70%酒精5min 50%酒精5min 30%酒精5min 蒸馏水5-10mi 1mol/LH的染色缸内(清洗一下) 温浴至60℃的1mol/LHCI溶液中水解8min 取出标本,放入室温1 mol/L HO溶液 (注意:这个步骤非常重要,必须用1moL稀盐酸冲洗,因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕 迹。如用蒸馏水冲洗,则试剂本身也可以水解,所释放出的碱性品红,可以使切片内一切嗜碱性物 质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚,可延长其水解时间,而且每次均需更换洗涤剂) 蒸馏水冲洗3次(使水解停止) Sch试剂中染色40min 用亚硫酸水洗3~5次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料) 流水冲洗5min 蒸馏水洗片刻 1%亮绿复染数秒钟 (注意:复染时间切忌过长,以免染色过深,影响对DNA的观察)
10 ↓ 95%酒精 5min ↓ 85%酒精 5min ↓ 70%酒精 5min ↓ 50%酒精 5min ↓ 30%酒精 5min ↓ 蒸馏水 5-10min ↓ 1 mol/L HCl 的染色缸内（清洗一下） ↓ 温浴至 60℃的 1 mol/L HCl 溶液中水解 8 min ↓ 取出标本，放入室温 1 mol/L HCl 溶液 （注意: 这个步骤非常重要，必须用 1 mol/L 稀盐酸冲洗，因为它可以洗去贴在切片上的试剂的痕 迹。如用蒸馏水冲洗，则试剂本身也可以水解，所释放出的碱性品红，可以使切片内一切嗜碱性物 质皆染色从而引起严重的错误。若切片较厚，可延长其水解时间，而且每次均需更换洗涤剂） ↓ 蒸馏水冲洗 3 次（使水解停止） ↓ Schiff 试剂中染色 40min ↓ 用亚硫酸水洗 3~5 次(以洗去多余的非特异性色素及扩散的染料) ↓ 流水冲洗 5 min ↓ 蒸馏水洗片刻 ↓ 1%亮绿复染数秒钟 （注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对 DNA 的观察）