南京军区南京总医院：《组织芯片应用的现状与前景》讲义

专家论坛 组织芯片应用的现状与前景 石群立,孟奎,陈琴,燕晓雯 (南京军区南京总医院病理科,江苏南京210002) 关键词:组织芯片;肿瘤;病理学 中图分类号:R361.2文献标识码:A文章编号:1671-2870(2005)01-0004-05 长期以来,各种传统的特殊染色技术、免疫组 织化学、原位杂交等研究方法均建立在常规病理组 织切片基础上,一张玻片上只能载有限的组织做 种测试,仅用于日常临床病理诊断尚可胜任,但要 从事大规模、多样本的科研则费时、费力。自1998 年由 Kononen等叫构建了第一个组织微阵列后,组 织芯片技术得到极大发展,其无疑给病理学研究开 辟了新天地。目前已有大量应用这一技术进行肿瘤 病理学研究的报道,短短数年国内关于运用组 图1b单个组织芯(乳腺浸润性导管癌)HE染色。 织芯片的文章已达126篇之多(截止2004年12 月)9其主要集中于免疫组织化学和原位杂交技 术在组织芯片上对各种不同肿瘤的研究,并充分体 现了该技术高通量( high-throughput)、快速、省时 用途广等优点,同时运用该技术也发现了一些肿瘤 特异性基因产物和与肿瘤生物学行为有关的免疫 标志物。当然在运用该技术时也发现了一些问题。 现就组织芯片的原理和特点、应用现状和对医学科 学发展的影响及其发展前景做一概述 图1c单个组织芯(乳腺浸润性导管癌) c-erbB2免疫组化染色阳性。 组织芯片的原理和特点 供体石蜡块 定位筛选 受体蜻块 组织芯片的概念 组 组织芯片 tissue chip)又称组织微阵列( tissue 阵列块 组织芯片 组织2 mIcroarray,TMA),是将数十个、数百个乃至上千个 小组织片整齐地排列在某一固相载体上(通常是载 图2TMA制作流程简图 玻片)而制成的微缩组织切片(图1a、1b、lc)。TMA 根据需要可制成下列不同的TMA:①多肿瘤 的制作流程主要包括组织筛选、定位、阵列蜡块的TMA( multitumor tma):由多种类型肿瘤组成2, 制作和切片等步骤(图2)明 用于肿瘤基因和(或)相关基因的筛选凹;②肿瘤进 展TMA( progression TMA):由不同发展阶段的肿瘤 (包括癌前病变、甚至正常组织)组织组成,用于肿 瘤不同发展阶段的基因变化研究;③预后TMA I J ( prognostic TMA):由治疗前后的肿瘤组织组成,用 于寻找与治疗和预后有关的标志物2;④其他 图1a9张由63个组织芯制成的“组织芯片”, TMAPS2:研究各类病原体等 分别进行HE和免疫组化染色 TMA的特点

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诊断学理论与实践2005年第4卷第1期 TMA的特点包括:①高通量:一次检测可获取 大量的生物学信息;②多样本:一次实验可分析成 TMA的应用现状 百上千种、同一或不同疾病的组织标本;③省时:1 2周内可完成数千个组织标本的数十个基因检测 肿瘤研究 或蛋白分子的定位、定量和定性分析;④简便经济 正因为TMA上可使用荧光原位杂交(FISH) 是传统病理学方法所需费用的1/100-1/10:⑤结果DNA、RNA杂交技术,且最具特征的是能在细胞水 可靠:一次实验可同时完成数干个组织标本的分平定位和蛋白水平检测,所以其与基因芯片的结合 析,减少批内和批间误差,实验结果更准确可靠;⑥使用具有极大的互补性,并扩大了获取信息的范 便于设计实验对照;⑦用途广泛:既可用于基础研围。目前应用生物芯片进行广泛的肿瘤研究,包括 究,又可用于临床研究。可用于分子诊断、预后指标对前列腺癌、乳腺癌、肾癌、膀胱癌、肺癌、 的筛选、治疗靶点的定位、抗体和药物的筛选、基因结肠癌、子宫内膜癌、卵巢癌、胶质瘤、黑色素瘤口、 和蛋白表达分析等;⑧可进行自动化分析:用特殊淋巴瘤等。 的扫描和分析仪器即可对TMA进行自动化分析 1.肿瘤新型标志物的筛选:基因芯片是由数 ⑨与其他生物技术[HE染色、免疫组织化学(IHC)、千至数万个已知的DNA或cDNA小片段构成 原位杂交(SH)、原位PCR、原位RT-PCR(ISRT-次可对数万个基因进行检测筛选,因此其具强大 PCR)等]相结合,就可组成免疫组织化学检测分析的基因检测功能但。但这些技术不能区分原发性 系统,若再与基因芯片、蛋白质芯片相结合,即可组与继发性改变的基因。因此基因芯片筛选出的 成完整的基因表达分析系统。 侯补肿瘤基因必需放到大量的病例中检验,且还 三、TMA设计、制作及使用过程中易出现的问需大量体外和体内实验的验证,传统的方法很难 题以及解决方法郾刘 完成这一耗时耗资的检验工作,而TMA技术却能 1芯片中组织片面积大小的选择:其选择关系迅速完成这一工作,即先将基因芯片筛选出的特 到对某一疾病是否具有代表性、实验结果的可靠殊基因做成探针,再将探针与TMA中众多的肿瘤 性:一般情况下,在直径为2mm的组织片上有约组织进行ISH,然后找出哪些基因产物与肿瘤具有 100000个细胞,而直径0.6mm的组织片上仅有约 相关性3-23。 Bubendorf等对前列腺癌激素治疗 30000个细胞。组织片太大,则失去了高通量、多样失败的病因学进行了cDNA芯片表达谱研究,并对 本、省时快速的意义;而组织片太小,则很难反映疾发现的高表达基因作了TMA验证,筛选到在前列 病的本质,同时也增加了人工观察和分析的难度。腺癌激素治疗失败的样本中显著表达的胰岛素样 所以在TMA设计中不是组织片的数量越多越好 生长因子结合蛋白2,提示胰岛素样生长因子可能 特别是在肿瘤分化程度的差异大或肿瘤的异质性是前列腺癌发展过程中关键的信号调节途径。 明显时,更要注意组织片大小的制定。目前,国际上 Barlund等m使用4209点的cDNA芯片发现了 常用的TMA的样本量多为60-100个,组织片的直MCF7乳腺癌细胞系中核糖体蛋白S6激酶过表达 径在2mm左右。 的基因,并将其定位在17q23区段,又运用TMA研 2.无效组织:减少或避免无效组织的关键是准究表明核糖体蛋白S6激酶不仅在乳腺癌细胞中高 确的组织定位;其次是TMA的厚度,多数专家认为表达,而且还具有很高的酶活性。进一步研究发现 以4-5mm为宜 核糖体蛋白S6激酶和HER2的高表达与较低的 3.组织片的移位或脱落:用阵列蜡块切片时,存活率显著相关。 若用水漂浮裱片,水温过高易导致组织片移位。使 2.肿瘤免疫表型研究:到2004年12月国内发 用石蜡切片辅助带移系统( paraffin section aid tape 表的126篇运用TMA研究的文章中大多为肿瘤免 transfer systen)进行干裱片及紫外线灯烤片,同时疫表型的研究。我们应用TMA进行了乳腺癌相关 再用01%的多聚赖氨酸等预处理载玻片,能有效蛋白的研究四,主要包括ER、PR、p53 C-erbB-2 地避免制片过程中组织片的移位或脱落。随着生物E- cadherin等,结果表明染色效果和实验结果与常 芯片信息计算机处理系统( (biochips computer pro-规病理学(大组织片)方法的结果一致四。另外还 cessing database)的冋世,使TMA的自动化分析和进行了淋巴瘤中颗粒酶B和穿孔素研究,结果表明 标准化成为可能。 两者存在于活化的T淋巴细胞中,在NK细胞淋

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J Diagn Concepts Pract 2005. Vol 4. N 巴瘤的诊断中具有重要价值叫。 Natkunam等叫应用 二、在其他方面的应用 TMA和HHC技术检测了1335个人类正常组织和 孙飞等四运用TMA技术分析妊高征胎盘组织 恶变组织中MUMI/RF4的表达情况,结果表明其中缺氧诱导因子-lα蛋白的表达情况,以探讨其发 在淋巴造血系统增生病变及恶性黑色素瘤中广泛病机理。 表达,而在人类其他肿瘤中未见表达。周小鸽等 TMA除可进行肿瘤抗体的筛选,还可进行药 选用了5种常用抗体[AEI/AE3、波形蛋白、白细胞物的筛选。结合基因芯片检测患者体內某些潜伏病 共同抗原(CD45)、结蛋白和S-100蛋白],运用毒(如HV)的遗传变异,比直接采用对患者可能不 TMA技术对54例正常组织及60例肿瘤组织进行起作用的药物要节省成本。 了HHC标记,结果证实波形蛋白表达于间叶细胞和 可以运用TMA对病理实验室质量和标准化进 间叶组织来源的肿瘤,亦见于一些上皮细胞和上皮行评估。 Parker等构建乳腺癌TMA分发给5个不 来源的肿瘤;CD45的表达见于几乎所有白细胞及同实验室,每个实验室用IHC方法检测乳腺癌细胞 淋巴细胞起源的肿瘤(霍奇金淋巴瘤中R-S细胞未ER的表达,以评估各实验室的操作流程和选用的 见CD45表达)。其研究结果与运用传统常规IHC抗体。另外TMA技术在各种染色对照中,包括特 标记结果完全一致。 Manley等收集了 Michigan大染、ⅢHC和ISH等的应用具有事半功倍的效果凹。 学肿瘤研究小组1995~2001年的前列腺癌病例 TMA还适用于形态学教学,可将具有特征性 1300例,用TMA及IHC(包括前列腺特异抗原、E-的形态区域组合构建TMA,相当于微缩的组织学 cadherin、p27及Ki-67)技术对其进行研究,取得满图谱,有利于医学生比较、学习 意的结果。 TMA技术是可以高效进行组织学、病理学、胚 3.肿瘤病因学研究:刘卫平等四运用NK淋胎学等研究的技术平台,能够在严格、均一的实验 巴瘤TMA,采用 DNA-RNA ISH技术检测了芯片上条件下,高通量、快速、平行地进行检测大批量组织 EB病毒编码的小分子mRNA,在杂交过程中,可见样本中的一个或多个实验指标。 TMA中的肿瘤细胞核上有清晰的EB病毒阳性信 号,提示NKT淋巴瘤与EB病毒有明显的相关性。 TMA的应用前景与展望 何煦等应用TMA技术研究肝癌与乙肝病毒感染 的关系,其结论为肝癌的发生与乙肝病毒感染有 基因功能研究是继基因组计划之后的重要课 密切关系,随着肝癌的发展,乙肝病毒抗原的表达题,TMA这一高通量生物技术是芯片技术家族新 降低 成员,实现了基因、蛋白质水平的研究与组织形态 与基因芯片联合应用:Oka等应用cDNA学相结合;TMA的发展为探索生命科学提供了强 阵列与TMA技术相结合,研究了SHP1基因在有力的工具,使一些原本复杂的工作变得简捷、快 NK/细胞淋巴瘤及其他几种淋巴瘤/白血病中的表速,使肿瘤研究的信息量更丰富,研究方法更高效 达。通过cDNA阵列的初步筛选,发现与正常NK 获得资料更直接。TMA可同时应用同一实验指标 细胞相比,SHP-1基因在NK-YS细胞系中明显减对大量不同类型的样本进行快速分析研究,减少实 少。又用207个不同类型的恶性淋巴瘤标本石蜡包验误差,数十倍、上百倍地提高组织病理学研究的 埋块制成TMA,检测其SHP-1蛋白的表达情况,结效率,节约实验材料和试剂;同时有较好的内对照 果表明,SHP-1基因的高表达在多种类型淋巴瘤的实验条件的可比性;另对原始病理资料的保存 发生中起着重要作用,在淋巴瘤/白血病以及NKT(病理标本的存档蜡块用量少)和大量样本的回顾 细胞淋巴瘤中SHP-1基因可能作为一个抑癌基因性研究均具有重要价值,该技术也越来越明显地显 存在。刘卫平等四取1例侵袭性NK细胞淋巴瘤 示出其优越性。正如Moch等所述,TMA在研究肿 的尸体解剖病例中不同部位的36个样本,手工制瘤的分子改变与临床病理特征的联系上将提供巨 作成TMA,采用 DNA-RNA ISH技术检测了该芯片大帮助,同时TMA也可用于基因产物的筛选、生物 上EB病毒编码的小分子mRNA,在杂交过程中,36试剂的测试、病理质量的控制及标准化、教学和考 片的TMA中,除3片掉片外,其余33片组织中均试以及制作微缩组织学和病理学图谱。将来不仅要 见有背景凊晰的EB病毒阳性信号,其定位于肿瘤建立一定规模的、具有各类型肿瘤的组织库,也要 细胞核。 建立正常组织的组织库,使TMA的构建形成系列

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诊断学理论与实践2005年第4卷第1期 化,为人类攻克癌症提供必要的实验研究材料。随 hematopoietic cell-specific tyrosine phosphatase SHP-1 着TMA技术的不断发展,病理学的作用将面临转 gene expression in natural killer cell lymphoma and va- 变,即在肿瘤分型时不再把重点放在组织学形态改 rious types of lymphomas/leukemias: combination anal 变上,而是从多方面、多水平地为临床治疗提供更 sis with cDNA expression array and tissue microarray [J 多资料。甚至在未来数年内,TMA技术的空间分辨 Am J Pathol,2001,1594):1495-1505 率将由现在的微米级向纳米级发展,相应的检测技 [12] Natkunam Y, Wamke RA, Montgomery K, et al. Analysis of MUMI/IRF4 protein expression using tissue microar- 术也将由现在的光学显微技术向共聚焦荧光显微 rays and immunohistochemistry [J]. Mod Pathol. 2001. 14 术、纳米显微术发展。相信在不久的将来,TMA技 7):686-694. 术在肿瘤的诊断和研究领域中将发挥更加重要的[13] Florell sr, Coffin cm, Holden jA,etal. Preservation of 作用。 RNA for functional genomic studies: a multidisciplinary tumor bank protocol[J). Mod Pathol, 2001, 14(2): 116-128. [参考文献] [14] Kipps TJ. Advances in classification and therapy of in- lolent B-cell malignancies[J]. Semin Oncol, 2002,29( [1 Kononen J, Bubendorf L Kallioniemi A et al. Tissue mi- croarays for high-throughput molecular profiling of tumor [15] Manley S, Mucci NR, De Marzo AM, et al.Relational specimens[J]. Nat Med, 1998, 4(7): 844-847 database structure to manage high-throughput tissue mi [21 Ekins R, Chu FW. Microarrays: their origins and applica croarray data and images for pathology studies focusing tions[J. Trends Biotechnol, 1999, 17(6: 217-218. on clinical outcome: the prostate specialized program of 3 Wooster R. Cancer classification with DNA microarrays research excellence model[J]. Am J Pathol, 2001, 1593) less more[J)? Trends Genet. 2000. 16(8): 327-329 837-843. [4 Moch H, Kononen T, Kallioniemi OP, et al. Tissue mi- [16 Bubendorf L, Kolmer M, Kononen J, et al. Hormone the- croarmays: what will they bring to molecular and anatomic rapy failure in human prostate: analysis by complementary pathology[J)? Adv Anat Pathol, 2001,8(1): 14-20 DNA and tissue microarrays[J). J Natl cancer Inst. 1999 Sallinen SL, Sallinen PK, Haapasalo HK, et al. Identifi- 1(20):1758-1764 catin of differentially expressed genes in human gliomas [17 Barlund M, Forozan F, Kononen J, et al. Detecting acti- by DNA microarray and tissue chip techniques[J. Cancer vation of ribosomal protein S6 kinase by complementary Res,2000.6023):6617-6622 DNA and tissue microarray analysis[J. J Natl Cancer Inst, 16 Richter J, Wagner U, Kononen J, et al. High-throughput 200092(15):1252-1259 tissue microarray analysis of cyclin e gene amplification [18 Parker RL, Huntsman DG, Lesack DW, et al. Assessment and overexpression in urinary bladder cancer [J]. Am J of interlaboratory variation in the immunohistochemical Pathol,2000157(3):787-794 determination of estrogen receptor status using a breast [7 Barlund M, Monni O, Kononen J, et al. Multiple genes at cancer tissue microarray [J). Am J Clin Pathol, 2002. 117 17q23 undergo amplification and overexpression in (5):723-728 breast cancer[J]. Cancer Res, 2000, 60(19): 5340-5344 [1】]王学民,李军,杜波,等.组织芯片的制备技术 8 Harris NL Jaffe ES, Diebold J, et al. The World Health 诊断病理学杂志,2002,96):370-371,01 Organization Classification of neoplastic diseases of the [20]周小鸽,张劲松,张小平,等.组织芯片技术在检测正 haematopoitic and lymphoid tissues: report of the Clinical 常组织和肿瘤组织抗原表达中的应用中华病理学 Advisory Committee Meeting, Airlie House, Virginia, 杂志,2002,31(2):181-182 November 1997[J). Histopathology, 2000,36(1): 69-86 [21]张建中,韩瑞刚,郑艳华,等.多肿瘤组织芯片在评价 19 Gaiser T, Thorns C, Merz H, et al. Gene profiling in 肿瘤细胞增殖与调亡状态研究中的作用J肿瘤防治 anaplastic large-cell lymphoma-derived cell lines with 杂志,2004,11(1)25-28 cDNA expression arrays(J). J Hematother Stem Cell Re.22)吕军,黄英武,向正华,等.组织芯片在筛选新型肿 200211(2:423-428 瘤分子标志物中的应用J生命的化学,2003,23(2:100 [10] Husson H. Carideo EG, Nerberg D, et al. Gene expres- sion profiling of follicular lymphoma and normal germinal23]石群立,孟奎,周晓军,等组织芯片检测乳腺癌相 enter B cells using cDNA arrays[J]. Blood, 2002,99(1) 关癌基因产物表达临床与实验病理学杂志,2003 282-289 [11 Oka T. Yoshino T, Hayashi K, et al. Reduction of [24石群立,周晓军,孟奎,等.组织芯片检测乳腺癌中

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