Purpose1.Learn the principle of building a recombinant plasmid2.Master the basic techniques of plasmid extraction, PCRtechnology ,digested and connection method.3.Understand the principle that prokaryotic cells expressrecombinantproteinvectors.4.Grasp the preliminary identification methods of therecombinant plasmid
Purpose 1. Learn the principle of building a recombinant plasmid 2. Master the basic techniques of plasmid extraction, PCR technology ,digested and connection method. 3. Understand the principle that prokaryotic cells express recombinant protein vectors. 4. Grasp the preliminary identification methods of the recombinant plasmid
1. PCR·PrimersequenceAnsbmy-1TCATGCCATGGATGACAAACGCGCAAAAAGAATAT(NcoI)Ansbmy-2AT:CCCAAGCTTTTATTTTTCTAATAGATCTTTTCCGG(HindII)
1. PCR • Primer sequence Ansbmy-1T: CATGCCATGGATGACAAACGCGCAAAAAGAATAT （NcoI） Ansbmy-2AT: CCCAAGCTTTTATTTTTCTAATAGATCTTTTCCGG （HindIII）
5 μl10XExTagBuffer4 μldNTPMixture(各2.5mmol/L)0.5 μlr Taq (5 u/μl)4 μlMgC122 μlForwardPrimer (20μmol/L)2 μlReversePrimer（(20umol/L)1 ulDNAtemplate(pET28a-AnsB)Steriledistilledwaterupto50μlPCR amplification program (Z1): 95 °C, 1.5min; 95 °C, 30 sec,52C,30 sec,72C,1.5min,30cycles;72C10min
10×Ex Taq Buffer 5 µl dNTP Mixture(各2.5 mmol/L) 4 µl r Taq（5 u/µl） 0.5 µl MgCl2 4 µl Forward Primer（20 μmol/L） 2 µl Reverse Primer（20 μmol/L） 2 µl DNA template (pET28a-AnsB) 1 µl Sterile distilled water up to 50 µl PCR amplification program (Z1)：95 ℃，1.5 min； 95 ℃，30 sec， 52 ℃，30 sec， 72 ℃，1.5 min，30 cycles；72 ℃ 10 min
U·DNA的模版为质粒pET22b-AnsB（预先准备）程序名为Z1。·PCR扩增程序：95℃，1.5min；95℃，30sec，50C,30sec,72,1.5min,30cycles;72℃ 10 min
• DNA的模版为质粒pET22b-AnsB（预先准备）， 程序名为Z1。 • PCR 扩增程序：95 ℃，1.5 min； 95 ℃，30 sec， 50 ℃，30 sec， 72 ℃，1.5 min，30 cycles；72 ℃ 10 min
·质粒提取·本实验所用的质粒为pET22b。培养条件：LB液体培养基（含氨苄100μg/ml），37℃200rpm摇床振荡，过夜培养。取3ml菌液离心（同一个EP管，重复离心两次），收集菌体，按照Axygen试剂盒的操作流程完成。注意事项培养液上清要清除干净，溶液2的裂解时间不宜过长加入溶液3后要上下颠倒充分混匀溶液1含有RNase，要4℃保存质粒提取完成后，溶解于50μl的eluent中质粒的电泳检测条件和PCR产物的电泳检测条件一样
• 质粒提取 • 本实验所用的质粒为pET22b。 培养条件：LB液体培养基（含氨苄100 µg/ml），37℃ 200 rpm摇床振荡，过夜 培养。取3ml菌液离心（同一个EP管，重复离心两次），收集菌体，按照Axygen 试剂盒的操作流程完成。 注意事项： 培养液上清要清除干净； 溶液2的裂解时间不宜过长； 加入溶液3后要上下颠倒充分混匀； 溶液1含有RNase，要4℃保存； 质粒提取完成后，溶解于50µl的eluent中； 质粒的电泳检测条件和PCR产物的电泳检测条件一样