食品工业中使用的酶大多数对酶的纯度要求不高,然而在某些特殊的情 况下却需要纯酶制剂,如在研究酶的结构、功能、生物学作用和理化性质 对酶进行鉴定,必须采用纯酶,作为生化试剂和药物酶对酶的纯度要求也高 根据酶在体内作用的部位,可以将酶分为胞外酶和胞内酶两大类。胞外 酶易于分离,而胞内酶存在于细胞内,必须破碎细胞才能进行分离。根据酶 是蛋白质这一特性,可采用提纯蛋白质的方法进行分离纯化 酶是生物活性物质,在提纯时必须考虑尽量减少酶活力的损失,全部操 作需要在低温下进行。一般在0~5℃范围,当用有机溶剂分级分离时应在-15 ℃~-20℃进行。在抽提溶剂中加入EDTA可螯合重金属,以防止酶失活;对 于含-SH的酶蛋白,需要加入少量巯基乙醇防止-SH氧化。干燥常采用真空冷 冻干燥,以减少酶活的损失。酶制品在一般在-20℃以下低温保存。 2.酶活力的测定 酶活力( enzyme activity)也称酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力 酶活力的大小可以用在一定条件下,它所催化的某一化学反应的反应速率来 表示,即酶催化的反应速率愈快,酶的活力就愈高,反之,速率愈慢,酶的 活力就愈低。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。而酶反应速率可 用单位时间内,单位体积中底物的减少量或底物的增加量来表示。因此,酶 的活力大小是以酶的活力单位为根据而定义。 1961年国际酶学会议规定,1个酶活力单位,是指在特定条件下,在1min 内能催化1μmol底物的量,或是转化底物中1μmol有关基团的酶量,称为 国际系统单位SI,即kat。特定条件:温度选定为25℃,其他条件(如p及 底物浓度)均采用最适条件。 酶活力单位只能作为相对比较,并不直接表示酶的绝对量,因此实际上 还需要测定酶的比活力( Specific activity),也就是酶含量的大小,即每mg 酶蛋白所具有的酶活力,一般用(U/mg蛋白质)表示。有时也用U/g或U/m1表 示。可以作为比较每单位酶蛋白的催化能力。对同一种酶而言,比活力愈高, 表示酶愈纯 第二节酶的催化反应动力学 酶催化反应动力学研究酶催化反应的速率,以及影响反应速率的各种因 素。食品中的酶仅能通过间接测定它们的催化活性而与其他酶区别,下面分 别讨论反应速率与反应物的浓度(主要指酶和底物)、活化剂与抑制剂 温度、反应介质的离子强度、水活性,以及其他环境条件的相关性
- 11 - 食品工业中使用的酶大多数对酶的纯度要求不高，然而在某些特殊的情 况下却需要纯酶制剂，如在研究酶的结构、功能、生物学作用和理化性质， 对酶进行鉴定，必须采用纯酶，作为生化试剂和药物酶对酶的纯度要求也高。 根据酶在体内作用的部位，可以将酶分为胞外酶和胞内酶两大类。胞外 酶易于分离，而胞内酶存在于细胞内，必须破碎细胞才能进行分离。根据酶 是蛋白质这一特性，可采用提纯蛋白质的方法进行分离纯化。 酶是生物活性物质，在提纯时必须考虑尽量减少酶活力的损失，全部操 作需要在低温下进行。一般在 0～5℃范围，当用有机溶剂分级分离时应在-15 ℃～-20℃进行。在抽提溶剂中加入 EDTA 可螯合重金属，以防止酶失活；对 于含-SH 的酶蛋白，需要加入少量巯基乙醇防止-SH 氧化。干燥常采用真空冷 冻干燥，以减少酶活的损失。酶制品在一般在-20℃以下低温保存。 2. 酶活力的测定 酶活力(enzyme activity)也称酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。 酶活力的大小可以用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的反应速率来 表示，即酶催化的反应速率愈快，酶的活力就愈高，反之，速率愈慢，酶的 活力就愈低。所以测定酶的活力就是测定酶促反应的速率。而酶反应速率可 用单位时间内，单位体积中底物的减少量或底物的增加量来表示。因此，酶 的活力大小是以酶的活力单位为根据而定义。 1961 年国际酶学会议规定，1 个酶活力单位，是指在特定条件下，在 1min 内能催化 1μmol 底物的量，或是转化底物中 1μmol 有关基团的酶量，称为 国际系统单位 SI，即 kat。特定条件：温度选定为 25℃，其他条件(如 pH 及 底物浓度)均采用最适条件。 酶活力单位只能作为相对比较，并不直接表示酶的绝对量，因此实际上 还需要测定酶的比活力(Specific activity),也就是酶含量的大小，即每 mg 酶蛋白所具有的酶活力，一般用(U/mg 蛋白质)表示。有时也用 U/g 或 U/ml 表 示。可以作为比较每单位酶蛋白的催化能力。对同一种酶而言，比活力愈高， 表示酶愈纯。 第二节 酶的催化反应动力学 酶催化反应动力学研究酶催化反应的速率，以及影响反应速率的各种因 素。食品中的酶仅能通过间接测定它们的催化活性而与其他酶区别，下面分 别讨论反应速率与反应物的浓度(主要指酶和底物)、活化剂与抑制剂、pH、 温度、反应介质的离子强度、水活性，以及其他环境条件的相关性
底物浓度的影响 1、米氏学说的意义 早在20世纪初就已经观察到了酶被底物饱和的现象,而这种现象在非酶 催化反应中则是不存在的。实际上底物对酶反应速率的影响比较复杂。以反 应速率ν对底物浓度[S]作图(图6-4),可以看到当底物浓度较低时,反应速 率与底物浓度的关系是呈正比关系,为一级反应,之后随着底物浓度的增加, 反应速率不是成直线增加,这一段反应表现为混合级反应。如果再继续加大[S] 底物浓度,曲线表现为零级反应,反应速率趋向一个极限。说明酶已被底物 饱和。这可以用1913年前后 Michaelis与 Menten提出的学说解释。首先考 虑单一底物的反应,酶(E)与底物(S)形成复合物E·S。 零级反应 混合级反应 一级反应 (Ao) [SI 图6-4酶反应速率与底物浓度的关系 然后E.S释放出产物P及游离形式的酶 KI E+ S e+ 已知在最高活性反应,E·S的形成速率与E·S的分解速率达到平衡前,持续 大约5msec。 在讨论上述反应时,首先假设: (1)底物浓度远大于酶的浓度,即[S]>[E]0,大多数酶促反应的[S]在 10-~102mol/范围,[E]为103~10mol/L,因此被酶结合的S量,亦即[E吲]
- 12 - 一、底物浓度的影响 1、米氏学说的意义 早在 20 世纪初就已经观察到了酶被底物饱和的现象，而这种现象在非酶 催化反应中则是不存在的。实际上底物对酶反应速率的影响比较复杂。以反 应速率 对底物浓度[S]作图(图 6-4)，可以看到当底物浓度较低时，反应速 率与底物浓度的关系是呈正比关系，为一级反应，之后随着底物浓度的增加， 反应速率不是成直线增加，这一段反应表现为混合级反应。如果再继续加大[S] 底物浓度，曲线表现为零级反应，反应速率趋向一个极限。说明酶已被底物 饱和。这可以用 1913 年前后 Michaelis 与 Menten 提出的学说解释。首先考 虑单一底物 v 的反应，酶(E)与底物(S)形成复合物 E·S。 零级反应 混合级反应 [S] K m 2 Vmax Vmax 0 v 一级反应 图 6-4 酶反应速率与底物浓度的关系 然后 E·S 释放出产物 P 及游离形式的酶： 2 E + S k 1 E S 1 E + P k k k - 2 已知在最高活性反应，E·S 的形成速率与 E·S 的分解速率达到平衡前，持续 大约 5msec。 在讨论上述反应时，首先假设： (1)底物浓度远大于酶的浓度，即[S]0>>[E]0,大多数酶促反应的[S]0在 10-4～10-2mol/L范围，[E]0为 10-8～10-6mol/L，因此被酶结合的S量，亦即[E·S]
它与总的底物浓度相比,可以忽略不计。 (2)产物P的浓度接近0时,不存在逆反应,即讨论酶反应初始速率。 (3)k控制生成产物P这一步的速率,远小于酶-底物配合物释放出底物这 一步的反应速率常数k。因此,k2为限制整个反应速率的反应速率常数,k2 接近0。E和E·S基本上处于平衡状态 般地说,上述假设是符合实际情况的,当达到平衡时上式可以写为: K,]=k_Es (6-1) [E]=k[ES] (6-2) 然而,在反应中总的酶浓度[E],必须等于游离酶的浓度[E]和[E·S]之和, 即[E]=[E]+[E·S]。代入(6-2)式可得 由于k2是限制步骤的反应速率常数,因此整个反应速率v=k2[E·S] 于是 k2IEl-k2EJS] 式中常数称为米氏常数( Michaelis constant)或Kn。当底物浓度很 高时,所有的酶都被底物所饱和,并变成E·S复合物,即[E]=[E·S]时,酶 促反应达到最大速率Vm,所以 k2[E] 用(6-4)除以(6-5)得 keLIS S Vmax is S]+K, 这就是米氏方程 Michaelis-Meten方程),它表明了当已知K和V时 酶反应速率常数与底物浓度之间的定量关系。 利用米氏方程讨论与实验所得到的曲线(图6-4)之间的关系。当[S]<Kn 时,式(6-6)可以近似地表示为y=ymS,于是v正比于[S],即与曲线初始阶 段的一级反应相符。然而,随着[S]的增加K,与[S]相比可以忽略时,则 v=Vm。可见利用米氏方程讨论的结果与实验得到的曲线是一致的。说明米 氏方程为单分子酶反应提供了一个很好的模型
- 13 - 它与总的底物浓度相比，可以忽略不计。 (2)产物 P 的浓度接近 0 时，不存在逆反应，即讨论酶反应初始速率。 (3)k2控制生成产物P这一步的速率，远小于酶-底物配合物释放出底物这 一步的反应速率常数 。因此， 为限制整个反应速率的反应速率常数， 接近 0。E和E·S基本上处于平衡状态。 −1 k 2 k −2 k 一般地说，上述假设是符合实际情况的，当达到平衡时上式可以写为： (6 2) [ES] [ES] [E] [E][S] [ES] (6 1) 1 1 1 1 = − = − − − k k k k 然而，在反应中总的酶浓度[E]t必须等于游离酶的浓度[E]和[E·S]之和， 即[E]t=[E]+[E·S]。代入(6-2)式可得： ) (6 3) [ES] [E] [E S](1 1 1 = ⋅ + − − k k t 由于 k2是限制步骤的反应速率常数，因此整个反应速率 v = k2 [E·S] 于是 (6 4) [S] [E] [S] [S] 1 [E] 1 1 2 1 1 2 − + = + = − − k k k k k k v t t 式中常数 1 高时，所有的酶都被底物所饱和，并变成 E·S 复合物，即[E]=[E·S]时，酶 促反应达到最大速率 ，所以 1 k k− 称为米氏常数(Michaelis constant)或 Km。当底物浓度很 Vmax Vmax = ［E·S］= ［E］t (6-5) 1 k 2 k 用(6-4)除以(6-5)得： (6 6) [S] [S] [E] [S] [E] [S] max 2 2 max − + = + = − m t m t K V v k K k V v 这就是米氏方程(Michaelis-Meten 方程)，它表明了当已知 和 时， 酶反应速率常数与底物浓度之间的定量关系。 Km Vmax 利用米氏方程讨论与实验所得到的曲线(图 6-4)之间的关系。当[S]<< 时，式(6-6)可以近似地表示为 Km Km v v [S] max = ，于是 正比于[S]，即与曲线初始阶 段的一级反应相符。然而，随着[S]的增加 与 [S]相比可以忽略时，则 = 。可见利用米氏方程讨论的结果与实验得到的曲线是一致的。说明米 氏方程为单分子酶反应提供了一个很好的模型。 v Km v Vmax
当酶促反应处于ν=1/2V的特殊情况时: a·{S] v-12 (6-7) 由此可知K的物理意义,即K值是当酶反应速率达到最大反应速率一半 时的底物浓度,它的单位为mo1/L。 米氏常数是酶学研究中的一个极为重要的常数,现作如下分析: (1)K是酶的特征常数之一,一般只与酶的性质有关,而与酶浓度无关 (2)如果一个酶有几种底物,则每一种底物对映一个特定的K值,K与 H和温度有关。因此,Kn作为常数是在pH和温度一定时,对一定底物而 (3)同一种酶有几种底物时,其中Kn最小的底物一般称为该酶的最适底 物或天然底物。 1/Km可近似地表示酶对底物亲和力的大小,1/Km愈大,表明酶的亲和力 愈大,也就是说达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就愈小。 (4)Kn不等于k1,只有在k2<k1、k1时,Kn才可看作是k(这里的k 实际上是E·S的解离平衡常数,而不是E+S生成E·S的平衡常数)。在某 些酶催化反应中,形成E·S的平衡迅速建立,E·S形成的速率大大地超过E·S 分解为产物的速率,例如胰蛋白酶、转化酶、乳酸脱氢酶、脂酶等。因此k k远远大于k2,在这种情况下ES“·P是整个反应中最慢的一步,也就是 限制反应速率的步骤。于是Kn=,k1和Kn才有共同涵义。 (5)在没有抑制剂(或仅有非竞争性抑制剂存在时,E·S分解速率和E·S 形成速率的比值符合米氏方程,称为Kn,而在另一情况下,Kn发生变化,不 符合米氏方程,此时的比值称为表观米氏常数Km (6)根据预先要求的反应速率,利用Kn和米氏方程可以求出实际应用中 需要加入的底物浓度和反应速率。 2.米氏常数的求法 以酶的v-S]图上可以得到Vm,再从1/2Vm可求得相应的[S],即K 值,但实际上不能得到真正的,而仅仅是一个近似值,因此也就不可能准 确测定Kn值。为了得到准确的Kn值, Lineweaver和 Adic等人对米氏方程 进行了修改,使之成为直线方程,然后用图解法求出准确的Kn值。 (1) Lineweaver-Burk法(双倒数作图法) Lineweaver--Burk法是对米氏方程的两边同时取倒数,即有下面形式:
- 14 - 当酶促反应处于 v =1/2 Vmax的特殊情况时： m m m K S K K v v ∴ = + = + ⋅ = [S] [ ] [S] 2 1 [S] [S] 2 max max （6-7） （6-8） 由此可知 的物理意义，即 值是当酶反应速率达到最大反应速率一半 时的底物浓度，它的单位为 mol/L。 Km Km 米氏常数是酶学研究中的一个极为重要的常数，现作如下分析： (1) Km是酶的特征常数之一，一般只与酶的性质有关，而与酶浓度无关。 (2)如果一个酶有几种底物，则每一种底物对映一个特定的 值， 与 pH 和温度有关。因此， 作为常数是在 pH 和温度一定时，对一定底物而言。 Km Km Km (3)同一种酶有几种底物时，其中 最小的底物一般称为该酶的最适底 物或天然底物。 Km 1/ 可近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/ 愈大，表明酶的亲和力 愈大，也就是说达到最大反应速率一半所需要的底物浓度就愈小。 Km Km (4) 不等于 ，只有在 << 、 时， 才可看作是 (这里的 实际上是 E·S 的解离平衡常数，而不是 E + S 生成 E·S 的平衡常数)。在某 些酶催化反应中，形成 E·S 的平衡迅速建立，E·S 形成的速率大大地超过 E·S 分解为产物的速率，例如胰蛋白酶、转化酶、乳酸脱氢酶、脂酶等。因此 、 远远大于 ，在这种情况下 E Km −1 k 2 k 1 k −1 k Km −1 k −1 k 1 k −1 k 2 k S P 2 k 是整个反应中最慢的一步，也就是 限制反应速率的步骤。于是 1 1 k k Km − = , k−1和 Km才有共同涵义。 (5)在没有抑制剂(或仅有非竞争性抑制剂存在时，E·S 分解速率和 E·S 形成速率的比值符合米氏方程，称为 ，而在另一情况下， 发生变化，不 符合米氏方程，此时的比值称为表观米氏常数 ′。 Km Km Km (6)根据预先要求的反应速率，利用 和米氏方程可以求出实际应用中 需要加入的底物浓度和反应速率。 Km 2.米氏常数的求法 以酶的 -[S]图上可以得到 ，再从 1/2 可求得相应的[S]，即Km 值，但实际上不能得到真正的 ，而仅仅是一个近似值，因此也就不可能准 确测定 值。为了得到准确的 值，Lineweaver和Eadic 等 人对米氏方程 进行了修改，使之成为直线方程，然后用图解法求出准确的 值。 v Vmax Vmax Vmax Km Km Km (1)Lineweaver-Burk 法(双倒数作图法) Lineweaver-Burk 法是对米氏方程的两边同时取倒数，即有下面形式： max max 1 [S] 1 v v K v m = + （6-9）
然后以1对作图,得到一条直线,外推至与x轴相交,直线在-x轴和 y轴的截距分别为上和1,直线的斜率为人。Kn=-1此法方便且最常 ax 用,但实验点过分集中在直线的左端,作图不易十分准确(图6-5)。 斜率= 图6-5双倒数作图法 3. Adic- Hofstee法 Tadic- Hofstee法又名ν-ν/[S]法,是将米氏方程改写为: 以ν对υ作图,得到一条直线,其y轴的截距为V,x轴截距为 斜率为 酶的K值范围很宽,一般在106~10-mol/L之间,表6-4列出了一些酶 的 表6-4一些酶的K值 酶 底物 K.(mo1/L) 过氧化氢酶 H202 2.5×10 转移酶 蔗糖 棉子糖 3.5×10 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸 1.2×10 a-酮戊二酸 2.0×10 NAD氧化型 2.5×10 NAD还原型 1.8×10 乳酸脱氢酶 丙酮酸 1.7×10 β-半乳糖苷酶乳糖 4.0×10
- 15 - 然后以 [S] 1 1 对 v 作图，得到一条直线，外推至与 x 轴相交，直线在-x 轴和 y 轴的截距分别为 max 1 1 K v m 和 ，直线的斜率为 max v Km 。 x 1 = - Km 此法方便且最常 用,但实验点过分集中在直线的左端，作图不易十分准确(图 6-5)。 v 1 Vmax K m max 1 V S 1 K m 1 − 图 6-5 双倒数作图法 3.Eadic-Hofstee 法 Eadic-Hofstee 法又名 v - v /[S]法，是将米氏方程改写为： max [S] V v v = −Km + 以 v对 [S] υ 作图，得到一条直线，其 y 轴的截距为Vmax，x 轴截距为 Km vmax ， 斜率为- Km。 酶的 Km值范围很宽，一般在 10-6～10-1mol/L之间，表 6-4 列出了一些酶 的 Km。 表 6-4 一些酶的 值 Km 酶 底物 Km (mol/L) 过氧化氢酶 H2O2 2.5×10-2 转移酶 蔗糖 2.8×10-2 棉子糖 3.5×10-1 谷氨酸脱氢酶 谷氨酸 1.2×10-4 α-酮戊二酸 2.0×10-3 NAD 氧化型 2.5×10-5 NAD 还原型 1.8×10-5 乳酸脱氢酶 丙酮酸 1.7×10-5 β-半乳糖苷酶 乳糖 4.0×10-3