环境生态工程实验DCMU（二氯苯基二甲基脲，dichlorophenyldimethylures，商品名为敌草隆，diuron)等除草剂是作用于光合作用光系统中质体醒Q结合部位。它们竞争性地替换与DI蛋白结合着的质体醒QB，导致电子传递受阻，抑制HilI反应的发生。非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被DCMU所抑制，而环式光合磷酸化则不被DCMU抑制
DCMU (二氯苯基二甲基脲，dichlorophenyl dimethylures,商品名为敌草隆，diuron)等除草剂是作 用于光合作用光系统II中质体醌QB结合部位 。它们竞争 性地替换与DI蛋白结合着的质体醌QB，导致电子传递 受阻，抑制Hill反应的发生。 非环式光合磷酸化与假环式光合磷酸化均可被DCMU所 抑制，而环式光合磷酸化则不被DCMU抑制
环境生态工程实验【实验步骤】·叶绿体的提取①将4g新鲜叶片去叶脉后剪碎，放于预冷的研钵，加入4mL预冷的提取液，研磨成匀浆，再加4mL预冷的提取液混，将所有的匀浆液用4层纱布过滤，弃去杂质。收集过滤液于离心管中，4℃1000rpm离心3min，收集上清液于一新的离心管，弃去沉淀。?4℃3000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀悬浮于冷的4mL提取液，即为叶绿体提取液。叶绿素含量的测定取0.1ml叶绿体悬浮液于7ml离心管，用4.9ml80%丙酮稀释到5ml，混匀后，在652nm下测定吸光度，来计算叶绿素含量。C(mg/mL)=OD652×1/34.5×稀释倍数用预先冷冻的提取液稀释叶绿体悬浮液，总体积8mL，使叶绿体悬浮液浓度约相当于叶绿素浓度为0.04mg/mL
• 叶绿体的提取 ① 将4g新鲜叶片去叶脉后剪碎，放于预冷的研钵，加入4mL预冷的提取 液，研磨成匀浆，再加4mL预冷的提取液混匀，将所有的匀浆液用4层 纱布过滤，弃去杂质。 ② 收集过滤液于离心管中，4℃1000rpm离心 3min，收集上清液于一新的 离心管，弃去沉淀。 ③ 4℃ 3000rpm离心5min，弃去上清液，将沉淀悬浮于冷的4mL提取液， 即为叶绿体提取液。 • 叶绿素含量的测定 取0.1ml叶绿体悬浮液于7ml离心管，用4.9ml 80％丙酮稀释到5ml，混 匀后，在652nm下测定吸光度，来计算叶绿素含量。 C(mg/mL)= OD652×1/34.5×稀释倍数 用预先冷冻的提取液稀释叶绿体悬浮液，总体积8mL，使叶绿体悬浮 液浓度约相当于叶绿素浓度为0.04mg/mL。 【实验步骤】
环境生态工程实验Hill反应取9支试管，包好黑纸并编号1-9，按下表所列试剂分别加入9支试管中。试管号提取液/mL叶绿体/mLDCMu/mL2.6-D/mL1.014.024.50.534.01.04和53.50.51.06和73.01.01.08和91.03.01.0提取缓冲液做参比，600nm读取1号管光密度，分别取0.5mL和1mL叶绿体悬浮液放入2号和3号试管中，立即于600nm读取光密度，再按表中要求加入叶绿体悬浮液于其它试管中然后把黑纸剥掉，将4号、6号和8号管放在距光源20cm处，把5号、7号和9号管放在距光源60cm处（注意：试管放在盛有水的烧杯中），10分钟后，立即用黑纸把试管包好放冰浴中，然后于600nm分别读取光密度
• Hill反应 取9支试管，包好黑纸并编号1-9，按下表所列试剂分别加入9支试管中。 提取缓冲液做参比，600nm读取1号管光密度，分别取0.5mL和1mL叶绿体悬浮液放入2号 和3号试管中，立即于600nm读取光密度，再按表中要求加入叶绿体悬浮液于其它试管中， 然后把黑纸剥掉, 将4号、6号和8号管放在距光源20cm处，把5号、7号和9号管放在距光源 60cm处（注意：试管放在盛有水的烧杯中），10分钟后，立即用黑纸把试管包好放冰 浴中，然后于600nm分别读取光密度。 试管号 提取液/mL 叶绿体/mL DCMu/mL 2.6-D/mL 1 4.0 - - 1.0 2 4.5 0.5 - - 3 4.0 1.0 - - 4和5 3.5 0.5 - 1.0 6和7 3.0 1.0 - 1.0 8和9 - 1.0 3.0 1.0
环境生态工程实验【注意事项】·叶绿体提取：在冰浴低温条件下操作，上清液和沉淀的保留与否。·希尔反应：每管反应的总体积相同，且做好标记：在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测定叶绿体含量时用丙酮稀释不同：光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上（冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）
【注意事项】 • 叶绿体提取： 在冰浴低温条件下操作， 上清液和沉淀的保留与否。 • 希尔反应: 每管反应的总体积相同，且做好标记； 在反应时，所加溶液为提取液稀释的叶绿体悬浮液，与测 定叶绿体含量时用丙酮稀释不同； 光照条件下取放试管时，千万注意不能将水溅到灯泡上（ 冷水溅到热的灯泡上会引起灯泡爆炸）
环境生态工程实验【思考与作业】·解释叶绿体浓度和光照强度对希尔反应有何影响？·DCMU抑制希尔反应活性的机理何在？·为得到理想的实验结果，在实验中应注意的主要问题何在？
【思考与作业】 • 解释叶绿体浓度和光照强度对希尔反应有 何影响？ • DCMU抑制希尔反应活性的机理何在？ • 为得到理想的实验结果，在实验中应注意 的主要问题何在？