1 Machanicalisolation 从高度液泡化的细胞, practice/this ttee fficult Cut plasmolyzed and the yield of viable tissue and protoplasts is meager. vantage, subsequent however is that the deplasmolysis deleterious effects of results in expansion the wall-degrading enzymes,plast festoon the and release of the metabolism of the protoplasts from theprotoplasts Protoplast released are cut ends of the cell eliminated
1、Machanical isolation • Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell. • In practice this technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager. One advantage, however, is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the protoplasts are eliminated. 从高度液泡化的细胞
2\ Enzymatic isolation 2-1材料 获得高质量的原生质体,应选择生长旺盛的植 物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体,来源 方便,有明显的叶绿体,便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂因此 常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料,最 适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。 双子叶外植体培养细胞。单子叶植物胚性细胞
2、Enzymatic isolation 双子叶外植体/培养细胞。 单子叶植物胚性细胞。 2-1 材料 获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植 物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源 方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此 常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最 适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞
2-2酶的种类和浓度 纤维素酶( Cellulase) Onozuka r-10 果胶酶( Pectolyase)Y23 半纤维素酶( Hemicellulase) 对幼叶来说,酶浓度较低:0.5%1%纤维 素酶,果胶酶(0.2%-0.5%);酶量少 对愈伤组织、悬浮细胞:纤维素酶、果胶 酶的浓度要提高到1%或2%。酶量大 酶液PH值:54-58 因为PH高,酶活性低 PH低,原生质体损坏多
2-2 酶的种类和浓度 纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase） 对幼叶来说，酶浓度较低：0.5％-1％纤维 素酶，果胶酶(0.2％-0.5％); 酶量少 对愈伤组织、悬浮细胞：纤维素酶、果胶 酶的浓度要提高到1％或2％。酶量大 酶液PH值：5.4-5.8 因为PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多
2-3酶液渗透压 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下,才 既不涨破,又不因过度收缩而破坏內部结构。因 些在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对 原生质体起保护作用。 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统,包括甘露醇, 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇,它们能稳定地 维持渗透浓度。浓度一般为04-0.8moL。而蔗 糖等易被原生质体吸收利用,降低渗透浓度,故 不常用
2-3 酶液渗透压 裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才 既不涨破，又不因过度收缩而破坏内部结构。因 此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对 原生质体起保护作用。 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、 山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地 维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗 糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故 不常用
2-4材料预处理(暗处理,预培养 和低温处理 在酶处理前,常把供体组织置于合适浓度的稳 压液中,使细胞预质壁分离约一小时后再用酶 液处理。 原因:预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露 增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降 解速度;降低原生质体内电解质渗漏,防止在 分离期间外来酶被吸入细胞内,降低原生质体 对酶液中可能存在的有害影响的敏感,提高原 生质体的稳定性和存活率
2-4 材料预处理 (暗处理，预培养 和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳 压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶 液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露， 增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降 解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在 分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体 对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原 生质体的稳定性和存活率