教学内容与设计： 教学提示 如果将溶液中生物分子稀释到过低的浓度，则需要加大反应容器并加入 更多的沉析剂，因此要得到理想的沉析效果，必须将生物分子的浓度控制在 一定的范围内。一般对于蛋白质溶液，其浓度为2%3%比较合适。 (四)pH值 副板书 通常情况下，如果生物分子表面携带的净电荷（不论正电荷和负电荷} 越多，就会产生越强的排斥力，使生物分子不容易聚集，此时溶解度就很大 如果调整溶液的pH,在某一个临界的pH值处出现生物分子对外表现净电荷 提问：何 谓等电 为零的情况，此时生物分子间的排斥力很小，生物分子很容易聚集后析出， 点？ 也就是说此时溶解度最低。这种情况下的pH值称为该生物分子的等电点(p), 对特定的生物分子，有盐离子存在时的pl与在纯粹水溶液中的会有一定的 偏差。在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶液的pH值调整到该成分的等 电点，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液的值偏离该成 分的等电点。 (五)温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。大多数情况下，在纯粹的水溶液或 副板书 低离子强度的溶液中。在一定的温度范围内，物质的溶解度会随温度的升高 而增加。但对于多数蛋白质、肽而言，在高盐浓度下，它们的溶解度反而会 随温度的升高而降低。只有少数蛋白质例外。如胃蛋白酶、大豆球蛋白，它 ]在高盐浓度下的溶解度随温度上升而增加。而卵球蛋白的溶解度几乎不受 温度影响。在蛋白质的分级沉析时，温度变化引起各种蛋白质溶解度的变化 是不相同的，所以在不同温度下，逐渐增加盐浓度所引起的各种蛋白质分级 沉析顺序，也是有变化的。在实际操作中应十分注意。盐析一般可在室温下 进行，当处理对温度敏感的蛋白质或酶时，盐析操作要在低温下（如0℃~4℃） 进行。 四、盐析的应用 PP (一)盐析的操作 副板书 盐析的具体操作对分离效果影响很大。下面是最常用的中性盐硫酸铵的 盐析操作方法。 1、盐的处理硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选 用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如 通入HS后过滤)，再将硫酸铵重结品备用
教学内容与设计： 如果将溶液中生物分子稀释到过低的浓度，则需要加大反应容器并加入 更多的沉析剂，因此要得到理想的沉析效果，必须将生物分子的浓度控制在 一定的范围内。一般对于蛋白质溶液，其浓度为 2％～3％比较合适。 （四） pH 值 通常情况下，如果生物分子表面携带的净电荷（不论正电荷和负电荷） 越多，就会产生越强的排斥力，使生物分子不容易聚集，此时溶解度就很大。 如果调整溶液的 pH，在某一个临界的 pH 值处出现生物分子对外表现净电荷 为零的情况，此时生物分子间的排斥力很小，生物分子很容易聚集后析出， 也就是说此时溶解度最低。这种情况下的pH值称为该生物分子的等电点（pI）。 对特定的生物分子，有盐离子存在时的 pI 与在纯粹水溶液中的 pI 会有一定的 偏差。在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶液的 pH 值调整到该成分的等 电点，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液的 pH 值偏离该成 分的等电点。 （五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。大多数情况下，在纯粹的水溶液或 低离子强度的溶液中。在一定的温度范围内，物质的溶解度会随温度的升高 而增加。但对于多数蛋白质、肽而言，在高盐浓度下，它们的溶解度反而会 随温度的升高而降低。只有少数蛋白质例外。如胃蛋白酶、大豆球蛋白，它 们在高盐浓度下的溶解度随温度上升而增加。而卵球蛋白的溶解度几乎不受 温度影响。在蛋白质的分级沉析时，温度变化引起各种蛋白质溶解度的变化 是不相同的，所以在不同温度下，逐渐增加盐浓度所引起的各种蛋白质分级 沉析顺序，也是有变化的。在实际操作中应十分注意。盐析一般可在室温下 进行，当处理对温度敏感的蛋白质或酶时，盐析操作要在低温下（如 0℃～4℃） 进行。 四、盐析的应用 （一）盐析的操作 盐析的具体操作对分离效果影响很大。下面是最常用的中性盐硫酸铵的 盐析操作方法。 1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选 用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如 通入 H2S 后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。 教学提示 副板书 提问：何 谓等电 点？ 副板书 PPT 副板书
教学内容与设计： |教学提示 2、加盐的方法 副板书 (1)直接加入固体硫酸铵法当需要较高的硫酸铵饱和度进行盐析，或不 希望增加处理样的体积时可采用该法。具体操作时，先将固体硫酸铵在低温 下研成细小的颗粒，边搅拌边缓慢向溶液中加入，避免出现局部浓度过高而 影响盐析效果以及生物活性成分的改变。 3、盐析操作注意事项 副板书 (1)盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min 以上才可进行固-液分离。 (2)经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进行第二次盐析要靠试验确定 (3)盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入方法、搅拌的速度、温度及 H等参数应严格控制。 (4)盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量 和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用 过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高 的离心速率和较长的离心时间。 (5)盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。 (二)盐析的主要应用 PPT 盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产生共沉作用，故其分辨 率不是很高，但配其他手段完全能达到很好的分离效果。由于成本低，操作 安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、 多肽、多糖、核酸等物质的分离纯化。蛋白质盐析的应用方法 蛋白质等生物分子在水中的溶解度与溶液中中性盐的离子强度有如下关 系（休格尔经验公式）： IogS=B-Ks·I 式中：S为蛋白质的溶解度，gL:B、Ks为盐析常数：I为离子强度。 式(4-3)是直线方程，但仅在一定的离子强度范围内适用。离子强度过 低或过高，都不呈线性关系。式中B值的大小取决于溶质的性质，不可能直 接测定，是假定在1=0时， 用外推法求出直线延长在纵轴的截距。故B值带有经验性质。Ks等于直线的 斜率的负值。 Ks值越大，B值越小，表示盐析能力越强。 思考题： 1、盐析的原理是什么？ 2、影响盐析的主要因素有哪些？
教学内容与设计： 2、加盐的方法 （1）直接加入固体硫酸铵法 当需要较高的硫酸铵饱和度进行盐析，或不 希望增加处理样的体积时可采用该法。具体操作时，先将固体硫酸铵在低温 下研成细小的颗粒，边搅拌边缓慢向溶液中加入，避免出现局部浓度过高而 影响盐析效果以及生物活性成分的改变。 3、盐析操作注意事项 （1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置 30min 以上才可进行固-液分离。 （2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进行第二次盐析要靠试验确定。 （3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入方法、搅拌的速度、温度及 pH 等参数应严格控制。 （4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量 和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用 过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高 的离心速率和较长的离心时间。 （5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。 （二）盐析的主要应用 盐析是最早使用的生化分离技术之一，由于易产生共沉作用，故其分辨 率不是很高，但配其他手段完全能达到很好的分离效果。由于成本低，操作 安全简单，对许多生物活性物质具有很好的稳定作用，常用于蛋白质、酶、 多肽、多糖、核酸等物质的分离纯化。蛋白质盐析的应用方法 蛋白质等生物分子在水中的溶解度与溶液中中性盐的离子强度有如下关 系（休格尔经验公式）： IogS=β－Ks·I 式中： S 为蛋白质的溶解度，g/L；β、Ks 为盐析常数；I 为离子强度。 式（4-3）是直线方程，但仅在一定的离子强度范围内适用。离子强度过 低或过高，都不呈线性关系。式中β值的大小取决于溶质的性质，不可能直 接测定，是假定在 I =0 时， 用外推法求出直线延长在纵轴的截距。故β值带有经验性质。Ks 等于直线的 斜率的负值。 Ks 值越大，β值越小，表示盐析能力越强。 思考题： 1、盐析的原理是什么？ 2、影响盐析的主要因素有哪些？ 教学提示 副板书 副板书 PPT