●● ●●●●● ●●●● 1、沉淀分离 ●●●● ●●●● 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质,使酶的溶解度 降低,而从溶液中沉淀析出,与其它溶质分离的技术过程 沉淀分离方法 分离原理 盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性,通过在 酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析出沉淀,从 而使酶与杂质分离 等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低,以及不同的两性电解质有 不同的等电点这一特性,通过调节溶液的pH值,使酶或杂质沉淀析 出,从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的 某种有机溶剂,使酶或杂质沉淀析出,从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 在酶液中加入某些物质,使它与酶形成复合物而沉淀下来,从而使 酶与杂质分离 选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀,而不影响所需 的酶,从而使酶与杂质分离
1、沉淀分离 沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度 降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。 沉淀分离方法 分离原理 盐析沉淀法 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在 酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从 而使酶与杂质分离 等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有 不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析 出，从而使酶与杂质分离 有机溶剂沉淀法 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的 某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离 复合沉淀法 在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使 酶与杂质分离 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需 的酶，从而使酶与杂质分离
■鹽析 Salting-out: ●● ●●●●● Salting-out ●●●● ●●●● le sairing-in effecr ●●●● Ammonium 溶解度 sulfate 在盐浓度达到某一界限 Sodium ulfate 后,酶的溶解度随盐浓 lonic strength 度升高而降低,这称为 蛋白質分子表面的疏水性區域都聚集許多水分 盐析现象 當鹽類加廴時’這些水分子被抽出’以便與鹽離子進 行水合’暴露出疏水性區域相互袺合’形成沉澱 在一定的温度和pH值条件下(β为常数),通过改变离子强度使不同的酶或蛋 白质分离的方法称为Ks分段盐析;而在一定的盐和离子强度的条件下(Ks/为常数) 通过改变温度和pH值,使不同的酶或蛋白质分离的方法,称为β分段盐析 在蛋白质的盐析中,通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、 氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而 且温度系数小,不影响酶的活性,分离效果好,而且价廉易得。然而用硫酸铵进行 盐析时,缓冲能力较差,而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定,所以有时也用其 它中性盐进行盐析。 在盐析时,溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示
在盐浓度达到某一界限 后，酶的溶解度随盐浓 度升高而降低，这称为 盐析现象。 在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋 白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI为常数）， 通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。 在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、 氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而 且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。然而用硫酸铵进行 盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其 它中性盐进行盐析。 在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示
●● ●●●●● Organic Solvent Precipitation ●●●● ●●●● ●●●● Membrane protein Water-solu ble pr otein Solvent %6 有杋溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使 溶液的介电常数降低。例如,20℃时水的介电常数为80,而82% 醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低,就使溶质分子 间的静电引力增大,互相吸引而易于凝集,同时,对于具有水膜 的分子来说,有机溶剂与水互相作用,使溶质分子表面的水膜破 坏,也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 目
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会使 溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙 醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子 间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜 的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破 坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等 本节 目录
●● ●●●●● ●●●● 2、离心分离 ●●●● ●●●● 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小 不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时,要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同,选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机,其最大转速在8000rmin以内,相对离心力 (RCF)在1×104g以下,在酶的分离纯化过程中,主要用于细胞、细胞 碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为(1~25)×10r/min,相对离心力达到 1×104~1×105g,在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的 分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速 离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机 超速离心机的最大转速达(25~12)×104rmin,相对离心力可以高达 5×105g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化;样品纯度的检测;沉降系数和相对分 子质量的测定等
2、离心分离 离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。 在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密 度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。 常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内，相对离心力 （RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞 碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的 分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变性失活,有些高速 离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。 超速离心机的最大转速达(2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对分 子质量的测定等
●● ●●●●● 高速離心與兩種超高速離心法的比較 高速離心 超高速離心 Gravity centrifugation I Zane Centrifugation I isopycnic Equilibration (無梯度) (預鑄梯度)->(陂段式梯度)<--(s梯度形成 集前时pads 争 Protein Chromosomal 沉降方向 卿DNA 降方向 Plasmid DNA 8e ( Open circular) Supercoiled Density Density Density Density 般的重力離心懂把 樣本:多為蛋白實 樣本:多為核酸 顆粒與溶液分離鬧來 密度相似丶分子量不同者 密度不同、分子量相似者