分子克隆实验小鼠β-actin基因片段T-A克隆及其鉴定201612
分子克隆实验 小鼠β-actin基因片段 T-A克隆及其鉴定 201612
实验原理T-A克隆重组：是简单的PCR产物直接重组方法原理：TaDNA聚合酶（具有有末端连接酶活性）在扩增目的基因片段时，可不依赖其模板，可在PCR产物两端（3’）自动加上碱基（尤其优先加上A）。为此，在T4DNA连接酶催化下，实现质粒载体（载体酶切切口具有游离T）和PCR产物的直接连接，实现DNA片段重组该法已广泛应用，如商品化载体如pGEM-T
T-A克隆重组：是简单的PCR产物直接重组方法 原理：TaqDNA聚合酶（具有有末端连接酶活性） 在扩增目的基因片段时，可不依赖其模板，可在 PCR产物两端（3’）自动加上碱基（尤其优先加 上A）。为此，在T4 DNA连接酶催化下，实现质粒 载体（载体酶切切口具有游离T）和PCR产物的直接 连接，实现DNA片段重组 该法已广泛应用，如商品化载体如pGEM-T 实验原理
EoRVe明7TA Cloning大轩菌感受李乳熊PMID19-TVecbr连接液SolutionI中包含FcoRV限制性酶及T4连接酶
ECORV识别位点EcoRV5.GATATC.33.CTATAG..5RFOORISRR!KotA001BMSoc887Hidm+→SacraRHHicnPctMCSlaczt酶切之后末端再添DMID19-Tor加T，就成可T克隆Vector质粒
酶切之后末端再添 加T,就成可T克隆 质粒
-互补筛选（蓝白色菌落筛选）原理：●pMD19-T质粒载体中具有LacZ（N)短区段，编码β-半糖苷酶N端146个AA（也称α-多肽），其前面的Plac可以启动LacZ(N)的转录和表达，但通常受抑制，在IPTG作用下，该抑制可去除；●受体菌大肠杆菌具有LacZ(C)短区段，可编码β-半乳糖苷酶C端部分；A-互补：当pMD19-T质粒载体转入相应大肠杆菌受体细胞中，LacZ(N)与LacZ(C)所编码产物可组合为一个具有活性的β-半糖苷酶全酶蛋白，从而使底物X-gal分解生色出现蓝色菌落；而当MCS序列区域内的LacZ(N)序列中插入外源基因后，该基因便不能正常表达，因此也就不能与受体菌实现α一互补作用，所以菌落呈白色。IPTG：异丙基硫代β一半乳糖苷
α-互补筛选（蓝白色菌落筛选） 原理： ⚫pMD19-T质粒载体中具有LacZ(N)短区段，编码β-半糖苷 酶N端 146个AA（也称α-多肽），其前面的Plac可以启动 LacZ(N)的转录和表达，但通常受抑制，在IPTG作用下，该 抑制可去除； ⚫受体菌大肠杆菌具有LacZ(C)短区段，可编码β-半乳糖 苷酶C端部分； Α-互补：当pMD19-T质粒载体转入相应大肠杆菌受体细 胞中，LacZ(N)与LacZ(C)所编码产物可组合为一个具有活 性的β-半糖苷酶全酶蛋白，从而使底物X-gal分解生色， 出现蓝色菌落；而当MCS序列区域内的LacZ(N)序列中插入 外源基因后，该基因便不能正常表达，因此也就不能与受 体菌实现α-互补作用，所以菌落呈白色。 IPTG：异丙基硫代β－半乳糖苷