、微生物的分离 (-)样品的采集 今土壤的营养:有机氮多--放线菌、细菌 有机氮少、酸性--真菌 今土壤深度: 放线菌和细菌--0-1m(80%在0-10cm) 真菌---0-0.3m 今未开垦过的土壤最佳 今南方地区土壤中的放线菌种类比北方多 今采样季节一春秋天为宜
（一）样品的采集 ❖ 土壤的营养：有机氮多----放线菌、细菌 ❖ 有机氮少、酸性----真菌 ❖ 土壤深度： 放线菌和细菌----0-1m（ 80%在0-10cm ） ❖ 真菌----0-0.3m ❖ 未开垦过的土壤最佳 ❖ 南方地区土壤中的放线菌种类比北方多 ❖ 采样季节一春秋天为宜 三、微生物的分离
(二)放线菌的分离 1样品分离前的处理 除去或减少不需要微生物,增加所需要放线菌的数量 (1)化学方法 SDS-酵母浸膏处理样品,可以使细菌数量明显减少 HV平板上55%~95%都是放线菌 风干的土壤与caCO3混合后培养,放线菌的数量可 以增加100倍。风干的土壤减少了细菌的数量 CaCO3有利于放线菌的生长,抑制了大多数真菌的 生长。 0.01 M NaoH处理土壤,分离小单孢菌,1M NaOH处理土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌 其他试剂:1.4%酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数 量明显减少,有利于分离放线菌
（二）放线菌的分离 1 样品分离前的处理 除去或减少不需要微生物，增加所需要放线菌的数量。 （1）化学方法 ❖ SDS-酵母浸膏处理样品，可以使细菌数量明显减少， HV平板上55%~95%都是放线菌。 ❖ 风干的土壤与CaCO3混合后培养，放线菌的数量可 以增加100倍。风干的土壤减少了细菌的数量； CaCO3有利于放线菌的生长，抑制了大多数真菌的 生长。 ❖ 0.01M NaOH处理土壤，分离小单孢菌，1M NaOH处理土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌。 ❖ 其他试剂：1.4%酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数 量明显减少，有利于分离放线菌
(2)物理方法 温度:根据各种微生物耐热程度的不同,用高温 处理样品,可以分离到不同种类的放线菌。 离心:根据微生物大小对样品进行离心分离。如 1600g离心20mn,上清液中主要是放线菌孢子 沉淀中含有细菌和真菌孢子。 膜过滤:用孔径为045um的滤膜可以浓缩水中 的微生物,过滤后把滤膜贴在平板培养基上培养 这种方法用来分离水中的小单孢菌和高温放线菌
（2）物理方法 ❖ 温度：根据各种微生物耐热程度的不同，用高温 处理样品，可以分离到不同种类的放线菌。 ❖ 离心：根据微生物大小对样品进行离心分离。如 1600g离心20min，上清液中主要是放线菌孢子， 沉淀中含有细菌和真菌孢子。 ❖ 膜过滤：用孔径为0.45μm的滤膜可以浓缩水中 的微生物，过滤后把滤膜贴在平板培养基上培养。 这种方法用来分离水中的小单孢菌和高温放线菌
2分离方法 (1)培养基 分离放线菌多采用合成培养基(精氨酸培养基、 高氏—号培养基、察氏培养基)和有机培养基 (如 Waksman培养基和 Benne培养基) (2)抗生素的加入 培养基中加入抗真菌抗生素和抗细菌抗生素,可 以抑制真菌和细菌的生长,对放线菌进行浓缩
2 分离方法 （1）培养基 分离放线菌多采用合成培养基（精氨酸培养基、 高氏一号培养基、察氏培养基）和有机培养基 （如Waksman培养基和Bennett培养基） （2）抗生素的加入 培养基中加入抗真菌抗生素和抗细菌抗生素，可 以抑制真菌和细菌的生长，对放线菌进行浓缩
(3)分离放线菌的方法 稀释法:无菌水稀释样品,然后涂布平板。 喷土法:用喷土机或其他方法把风干碾细的土样 直接喷在分离平板上。 ◆滤膜法:将0.22-0.45μm的滤膜放在分离培养 基的平板上,接种培养,放线菌菌丝可以穿过滤 膜长到培养基中,而细菌在滤膜表面生长,去掉 滤膜,培养基中的放线菌菌丝继续培养长出菌落。 (4)培养温度:一般25-30度,或者32-37度,培 养7-14天;高温放线菌需要45-50度培养1-2天 海水中分离放线菌用20度培养6周左右
（3）分离放线菌的方法 ❖ 稀释法：无菌水稀释样品，然后涂布平板。 ❖ 喷土法：用喷土机或其他方法把风干碾细的土样 直接喷在分离平板上。 ❖ 滤膜法：将0.22-0.45 μm的滤膜放在分离培养 基的平板上，接种培养，放线菌菌丝可以穿过滤 膜长到培养基中，而细菌在滤膜表面生长，去掉 滤膜，培养基中的放线菌菌丝继续培养长出菌落。 （4）培养温度：一般25-30度，或者32-37度，培 养7-14天；高温放线菌需要45-50度培养1-2天， 海水中分离放线菌用20度培养6周左右