仲恺农业技术学院学报,16(4):64~71,2003 Journal d zhongkai agrotechnical College 文章编号:1006-0774(2003)04.0064.08 植物原生质体培养和体细胞融合 技术研究进展 李杰2,黄敏仁1∵,王明庥,蔡汝2 (1.南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室,江苏南京210037 2.江苏省兰花工程研究中心,江苏泰州225321) 摘要:自20世纪70年代以来,植物原生质体培养和体细胞融合操作技术不断趋于精密化微量 化、高效化与多样化.文章侧重于实验操作技术和当前研究热点,对植物原生质体培养和体细胞 杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行了综述,并对其在理论和实践上的应用前 景及未来发展趋势进行了展望 关键词:植物;原生质体培养;体细胞融合;研究进展 中图分类号:S682.31 文献标识码:A 植物原生质体培养和体细胞融合技术作为细胞工程技术的重要分支,一直是20世纪70 年代以来的研究热点.30多年来,随着一系列关键性实验方法的发展和技术难关的逐步突 破,原生质体培养和体细胞融合技术己广泛应用于生物科学众多领域的研究,尤其是在通过 这样的实验体系进行植物品种改良和创造远源杂种方面取得了可喜的进展.近年来有关该 领域的研究综述颇多,但大多是针对某一具体植物研究结果的总结,而针对更具普遍指导意 义的操作技术评述较少.结合国内外有关文献,侧重于实验操作技术,作者对植物原生质体 培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行综述,以期为相关领域 的研究提供参考 植物原生质体的培养 据许智宏等介绍,自从1971年 Nagata和 Takebe首次利用烟草叶片分离原生质体,并 培养获得再生植株以来,迄今至少已有46个科160多个属的360多种植物(含变种和亚种) 的原生质体再生植株问世 1.1植物原生质体的游离 原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节.目前,游离植物原生质体的常 收稿日期:2003-04-23 基金项目:国家“863”高技术研究计划(200AA244011资助项目 作者简介:李杰(1974-),男,四川巴中人,在读博士生.·通信作者 2 o1994-2008 China Academic ournal Electronic Publishing House. All rights reserved. htp: //wwnw cnki, net
仲恺农业技术学院学报 ,16(4) :64～71 ,2003 Journal of Zhongkai Agrotechnical College 文章编号 :1006 - 0774(2003) 04 - 0064 - 08 收稿日期 :2003 - 04 - 23 基金项目 :国家“863”高技术研究计划(2001AA244011) 资助项目. 作者简介 :李 杰(1974 - ) ,男 ,四川巴中人 ,在读博士生. 3 通信作者. 植物原生质体培养和体细胞融合 技术研究进展 李 杰1 ,2 , 黄敏仁1 3 , 王明庥1 , 蔡 汝2 (1. 南京林业大学林木遗传和基因工程国家林业局重点实验室 ,江苏 南京 210037 ; 2. 江苏省兰花工程研究中心 ,江苏 泰州 225321) 摘要 :自 20 世纪 70 年代以来 ,植物原生质体培养和体细胞融合操作技术不断趋于精密化、微量 化、高效化与多样化. 文章侧重于实验操作技术和当前研究热点 ,对植物原生质体培养和体细胞 杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行了综述 ,并对其在理论和实践上的应用前 景及未来发展趋势进行了展望. 关键词 :植物 ; 原生质体培养 ; 体细胞融合 ; 研究进展 中图分类号 :S682. 31 文献标识码 :A 植物原生质体培养和体细胞融合技术作为细胞工程技术的重要分支 ,一直是 20 世纪 70 年代以来的研究热点. 30 多年来 ,随着一系列关键性实验方法的发展和技术难关的逐步突 破 ,原生质体培养和体细胞融合技术己广泛应用于生物科学众多领域的研究 ,尤其是在通过 这样的实验体系进行植物品种改良和创造远源杂种方面取得了可喜的进展. 近年来有关该 领域的研究综述颇多 ,但大多是针对某一具体植物研究结果的总结 ,而针对更具普遍指导意 义的操作技术评述较少. 结合国内外有关文献 ,侧重于实验操作技术 ,作者对植物原生质体 培养和体细胞杂交等关键技术环节的重要研究成果和研究进展进行综述 ,以期为相关领域 的研究提供参考. 1 植物原生质体的培养 据许智宏等[1 ]介绍 ,自从 1971 年 Nagata 和 Takebe 首次利用烟草叶片分离原生质体 ,并 培养获得再生植株以来 ,迄今至少已有 46 个科 160 多个属的 360 多种植物(含变种和亚种) 的原生质体再生植株问世. 111 植物原生质体的游离 原生质体的游离是原生质体培养成功的一个重要环节. 目前 ,游离植物原生质体的常 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第4期李杰等植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 规方法是酶解法.用酶解法游离原生质体时,首先要考虑植物材料的正确选择.一般情况 下,当植物处于最佳生长状态时取材,分离的效果最为理想.如茄科植物一般选取生长旺 盛、生理状态一致的试管苗上部叶片121,而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材 料3.一个处于指数期快速生长的细胞培养体系,如愈伤组织或悬浮培养物,最适宜作为游 离原生质体的材料.其次,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度.目前市场上出现了许多 游离原生质体的酶制品,但各种酶的性质活性、纯度及作用有很大的差别,选用时应根据植 物材料和酶制品的特性进行综合考虑.此外,还必须控制好酶解条件.影响酶解过程的主要 因素有温度φH值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等.一般情况下,酶解温度为25 30℃酶解液的pH值根据所用酶种类的不同可以在5.4~62之间变动,渗压剂的使用浓 度,一般控制在0.45~0.8mm/L范围内.酶解前对材料进行轻微的质壁分离,酶解时低速 振荡(40r/min)以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl2和MCl2)等能提高原生质体的产量和 质量.原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法.漂浮法在洗涤纯化 过程中对原生质体的损伤较小,但对离心力要求严格,不易掌握,沉降界面法易造成原生质 体损伤,但操作简单.具体选择方法则依实验条件而定 1.2原生质体的培养 在培养方式上,植物原生质烋培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及 在此基础上发展起来的一些其它培养方式.固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活 率,利于定点观察,但不利于通气和培养后期代谢物的排出.相比而言,多数实验者喜欢采 用液体浅层培养法.这种方法的优点是培养物与空气接触面大,易于通气,添加更换培养基 和转移操作方便,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散,但不利于定点观察,易造 成原生质体局部密度过高或过低.在固液双层培养法中, Shillito等建立的念珠培养法是比 较好的一种方法,它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振 荡培养.用这种方法,明显提高了矮牵牛( Petunia hvbnidia)、番茄( Lycopersicum esculentum)、芜 菁( Brassica ra)等原生质体培养的植板率.在上述培养方式中,均可以加入未去壁但失 去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养( nurse culture),能明显提高培养效果.Mt gu等用这样的方法,极大提高了百合(LimL.)原生质体培养初期的成活率 在培养基的选择上,两种最常用的培养基为8P和NT,它们分别是由B5和MS培养基改 良而形成的.在这些基本培养基的基础上,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行 适当修改大量元素中Mg2+c2+浓度变化最多,铵态氮和硝态氮的比例及用量,不同实验 也不尽相同.对碳源的要求一般不专一,多数采用蔗糖,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为 碳源营养.在激素使用上,般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正 常分裂和生长.最常用的外源生长素是2,4D,但对细胞分裂素的需求,各种文献报道不 致。原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变.如烟草( nicotiana abacus)原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后,会迅速生长并随之发生植株 再生6.此外,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响.如鸟氨酸和丁 二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利,亚精胺-精胺类多胺物质则对 禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用.在培养密度和条件上,根据物种和材料来源的 201994-2008ChinaaCademicournalElectronicPublishingHouse.dllrightsreservedhttp://www.cnki.ner
规方法是酶解法. 用酶解法游离原生质体时 ,首先要考虑植物材料的正确选择. 一般情况 下 ,当植物处于最佳生长状态时取材 ,分离的效果最为理想. 如茄科植物一般选取生长旺 盛、生理状态一致的试管苗上部叶片[2 ] ,而禾本科植物大多数选取胚性悬浮细胞系为材 料[3 ] . 一个处于指数期快速生长的细胞培养体系 ,如愈伤组织或悬浮培养物 ,最适宜作为游 离原生质体的材料. 其次 ,要选择合适的水解酶种类、组合及浓度. 目前市场上出现了许多 游离原生质体的酶制品 ,但各种酶的性质、活性、纯度及作用有很大的差别 ,选用时应根据植 物材料和酶制品的特性进行综合考虑. 此外 ,还必须控制好酶解条件. 影响酶解过程的主要 因素有温度、pH 值、渗透压、离子浓度、振荡及预处理等. 一般情况下 ,酶解温度为 25～ 30 ℃,酶解液的 pH 值根据所用酶种类的不同可以在 514～612 之间变动 ,渗压剂的使用浓 度 ,一般控制在 0145～018 mmol/ L 范围内. 酶解前对材料进行轻微的质壁分离 ,酶解时低速 振荡(40 r/ min) 以及酶解液中高钙镁离子浓度(CaCl2 和 MgCl2 ) 等能提高原生质体的产量和 质量. 原生质体成功游离后的提纯方法常用的有漂浮法和沉降界面法. 漂浮法在洗涤纯化 过程中对原生质体的损伤较小 ,但对离心力要求严格 ,不易掌握 ,沉降界面法易造成原生质 体损伤 ,但操作简单. 具体选择方法则依实验条件而定. 112 原生质体的培养 在培养方式上 ,植物原生质体培养常采用固体包埋培养、液体培养、固液双层培养以及 在此基础上发展起来的一些其它培养方式. 固体包埋培养能提高培养初期原生质体的成活 率 ,利于定点观察 ,但不利于通气和培养后期代谢物的排出. 相比而言 ,多数实验者喜欢采 用液体浅层培养法. 这种方法的优点是培养物与空气接触面大 ,易于通气 ,添加更换培养基 和转移操作方便 ,细胞悬浮培养中产生的有害代谢产物易于扩散 ,但不利于定点观察 ,易造 成原生质体局部密度过高或过低. 在固液双层培养法中 ,Shillito 等[4 ]建立的念珠培养法是比 较好的一种方法 , 它是将含有原生质体的琼脂糖培养基切成小块放在液体培养基中进行振 荡培养. 用这种方法 ,明显提高了矮牵牛( Petunia hybridia) 、番茄( Lycopersicum esculentum) 、芜 菁( Brassica rapa) 等原生质体培养的植板率[4 ] . 在上述培养方式中 ,均可以加入未去壁但失 去分化能力的完整细胞进行原生质体的看护培养(nurse culture) ,能明显提高培养效果. Mit2 sugu 等[5 ]用这样的方法 ,极大提高了百合(Lilium L. ) 原生质体培养初期的成活率. 在培养基的选择上 ,两种最常用的培养基为 8P 和 NT ,它们分别是由 B5 和 MS 培养基改 良而形成的. 在这些基本培养基的基础上 ,针对不同植物材料和不同的培养阶段可以进行 适当修改. 大量元素中 Mg2 + 、Ca2 +浓度变化最多 ,铵态氮和硝态氮的比例及用量 ,不同实验 也不尽相同. 对碳源的要求一般不专一 ,多数采用蔗糖 ,或者以蔗糖和葡萄糖混合使用作为 碳源营养. 在激素使用上 ,一般须在含有一种生长素和一种细胞分裂素的培养基中才能正 常分裂和生长. 最常用的外源生长素是 2 ,42D ,但对细胞分裂素的需求 ,各种文献报道不一 致. 原生质体对外源激素的需求可能会随培养时间的推移而发生改变. 如烟草 (Nicotiana tabacum) 原生质体在培养基中生长素水平降低或其作用消除后 ,会迅速生长并随之发生植株 再生[6 ] . 此外 ,还发现一些其它化合物对原生质体的生长和分裂有一定影响. 如鸟氨酸和丁 二胺对木本植物的叶组织原生质体分裂和细胞团形成有利 ,亚精胺 - 精胺类多胺物质则对 禾谷类植物的原生质体分裂有促进作用[6 ] . 在培养密度和条件上 ,根据物种和材料来源的 第 4 期 李 杰 ,等 :植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 56 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
仲恺农业技术学院学报 第16卷 不同,一般可在3×103~1×105个/m原生质体之间变动,培养初期往往要求黑暗或弱光条 件,对大部分植物种来说,25℃的培养温度pH5.5~5.7的范围是合适的 1.3原生质体的植株再生 原生质体的植株再生途径通常有3条:①经细胞团发育形成愈伤组织,再分化成芽长成 植株;②直接形成胚状体,再发育成植株;③先形成愈伤组织,再由愈伤组织分化形成胚状 体,最后发育成植株.分化和再生所需培养基的营养成分一般与同种植物正常离体组织培 养的要求相似但其分化和植株再生能力受供体植物的染色体组型和基因型影响.曾有文 献门介绍,油菜( Brassica campestris)的再生能力以AABB染色体组品种最强,AACC次之,AA 最差.Koua等围报道,籼稻( Onza sativa subsp. indica)、粳稻(O. sativa subsp. Japonica)和野 生稻(O. minuta)的不同基因型在分化和再生能力方面表现出基因特异性.甚至同一品种的 不同个体之间也表现出这样的差异.据黄白渠介绍,在同一品种的苜蓿( Medicago sativa) 中,来自不同植株的原生质体分裂和形成胚状体的潜力是不同的.最初由原生质体成功地 再生出植株的是茄科的一些植物,如烟草和矮牵牛,这些物种长期以来一直被用来作为研究 原生质体培养和植株再生的模式植物.20世纪80年代以来,原生质体植株再生的研究在许 多植物中取得突破性进展,已经获得了若干种有重要经济价值的原生质体再生植株,包括禾 谷类的水稻(O.saia)、玉米( Zea mays)、小麦( Triticum aestivum)、甘蔗( Saccharum sinense)、高 梁( Saccharum bicolor,豆科中的大豆(( divine max)、花生( Arachis hypogaea)、蚕豆/ icia faba) 苜蓿(M. sanva),重要经济作物中的棉花(G. hirsulum spp.)、甜菜( Beta var.rqpu及重要木本 植物咖啡( Coffea stenophylla)、苹果( Malus pumila)、梨(Pnsp.)、龙眼( Dimocarpus longan)、 猕猴桃 Actinidia chinensis)、杨树( populusφp.)、泡桐( Paulownia spp.)、白云杉( Picea glar ca)、观赏植物菊花( Chrysanthemum morifolium)、康乃馨( Dianthus caryophyllus)、天竺葵 Pelargonium honorum)等.再生植株着重于农作物和经济植物,并从一年生向多年生、草 本向木本、高等植物向低等植物、体细胞向生殖细胞扩展.总结原生质体植株再生成功的经 验,有3个共性的关键因素:①选择合适的基因型;②利用胚性悬浮细胞或愈伤组织作为分 离原生质体的材料;③培养条件适宜.尽管原生质体培养取得了令人鼓舞的成功,但原生质 体培养的稳定性和可重复性差,存在很强的经验性,得到的原生质体再生植株仅占已进行原 生质体培养的数百种植物中的一部分,而且原生质体分裂、分化的潜在生理生化本质和机 制,以及各种影响因素需作深入的研究 植物体细胞的融合 从原生质体再生完整植株的成功,最终引发了将不同遗传背景的细胞组合在一起的尝 试.经过近30年的努力,人们建立起一套完整的体细胞杂交体系,它可能使不能通过有性过 程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组.这套技术体系包括诱导原生质体 的融合、选择融合体或杂种细胞及杂种植株的再生与鉴定 2.1原生质体融合技术的进展 原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程.早期使用的有NaNO法、高 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouseallrightsreservedhttp:/www.cnki.ner
不同 ,一般可在 3 ×103～1 ×105 个/ ml 原生质体之间变动 ,培养初期往往要求黑暗或弱光条 件 ,对大部分植物种来说 ,25 ℃的培养温度 ,pH 515～517 的范围是合适的. 113 原生质体的植株再生 原生质体的植株再生途径通常有 3 条 : ①经细胞团发育形成愈伤组织 ,再分化成芽长成 植株 ; ②直接形成胚状体 ,再发育成植株 ; ③先形成愈伤组织 ,再由愈伤组织分化形成胚状 体 ,最后发育成植株. 分化和再生所需培养基的营养成分一般与同种植物正常离体组织培 养的要求相似 ,但其分化和植株再生能力受供体植物的染色体组型和基因型影响. 曾有文 献[7 ]介绍 ,油菜( Brassica campestris) 的再生能力以 AABB 染色体组品种最强 ,AACC 次之 ,AA 最差. Kyozuka 等[8 ]报道 ,籼稻( Oryza sativa subsp. indica) 、粳稻( O. sativa subsp. japonica) 和野 生稻( O. minuta) 的不同基因型在分化和再生能力方面表现出基因特异性. 甚至同一品种的 不同个体之间也表现出这样的差异. 据黄白渠[6 ]介绍 ,在同一品种的苜蓿 ( Medicago sativa) 中 ,来自不同植株的原生质体分裂和形成胚状体的潜力是不同的. 最初由原生质体成功地 再生出植株的是茄科的一些植物 ,如烟草和矮牵牛 ,这些物种长期以来一直被用来作为研究 原生质体培养和植株再生的模式植物. 20 世纪 80 年代以来 ,原生质体植株再生的研究在许 多植物中取得突破性进展 ,已经获得了若干种有重要经济价值的原生质体再生植株 ,包括禾 谷类的水稻( O. sativa) 、玉米( Zea mays) 、小麦( Triticum aestivum) 、甘蔗( Saccharum sinense) 、高 粱( Saccharum bicolor) ,豆科中的大豆( Glycine max) 、花生( Arachis hypogaea) 、蚕豆( Vicia faba) 、 苜蓿( M. sativa) ,重要经济作物中的棉花( G. hirsulum spp. ) 、甜菜( Beta var. rapa) 及重要木本 植物咖啡( Coffea stenophylla) 、苹果( Malus pumila) 、梨( Pyrus spp. ) 、龙眼( Dimocarpus longan) 、 猕猴桃( Actinidia chinensis) 、杨树 ( Populus spp. ) 、泡桐 ( Paulownia spp. ) 、白云杉 ( Picea glau2 ca) 、观 赏 植 物 菊 花 ( Chrysanthemum morifolium ) 、康 乃 馨 ( Dianthus caryophyllus) 、天 竺 葵 ( Pelargonium hortorum) 等[1 ] . 再生植株着重于农作物和经济植物 ,并从一年生向多年生、草 本向木本、高等植物向低等植物、体细胞向生殖细胞扩展. 总结原生质体植株再生成功的经 验 ,有 3 个共性的关键因素 : ①选择合适的基因型 ; ②利用胚性悬浮细胞或愈伤组织作为分 离原生质体的材料 ; ③培养条件适宜. 尽管原生质体培养取得了令人鼓舞的成功 ,但原生质 体培养的稳定性和可重复性差 ,存在很强的经验性 ,得到的原生质体再生植株仅占已进行原 生质体培养的数百种植物中的一部分 ,而且原生质体分裂、分化的潜在生理生化本质和机 制 ,以及各种影响因素需作深入的研究. 2 植物体细胞的融合 从原生质体再生完整植株的成功 ,最终引发了将不同遗传背景的细胞组合在一起的尝 试. 经过近 30 年的努力 ,人们建立起一套完整的体细胞杂交体系 ,它可能使不能通过有性过 程杂交的亲本之间进行核基因的重组或胞质基因的重组. 这套技术体系包括诱导原生质体 的融合、选择融合体或杂种细胞及杂种植株的再生与鉴定. 211 原生质体融合技术的进展 原生质体的融合方法经历了一个逐步改进和完善的过程. 早期使用的有 NaNO3 法、高 66 仲恺农业技术学院学报 第 16 卷 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
第4期李杰等植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 钙高pH法、PEG法等后来相继发展了PEG与高a2+、高pH值相结合的方法(也简称PEG 法)、电融合法以及聚集微束激光法.目前广泛使用的是PEG法和电融合法.PEG法是采用 聚乙二醇为融合剂的一种化学方法,使用简便、经济、可重复性强,已成功使近百个实验获得 体细胞杂种.PEG法诱导原生质体融合时,一般所用分子量为1500~6000,浓度为15%~ 45%.PEG法的缺点是处理时间、PEG分子量、诱导液的浓度等不易掌握,且易形成多元融合 物还有待于完善.电场融合是目前最流行的物理诱导融合法,它是20世纪80年代初迅速 崛起的一种细胞融合技术.近年来,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在 医学分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文.迄今为止,通过电融合反复实验,已 测出了数十种植物原生质体的电融合参数,如水稻、小麦、燕麦( Arena sativa L)、马铃薯 ( Solanum tuberous)油菜(B. campesinos)、胡萝卜( Daucus carota)、菜豆( Phaseolus vu ganis)、蚕 豆烟草矮牵牛等,并成功获得部分细胞杂种.原生质体在融合液中的接触和融合受到 外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca2+Mg2浓度添加的化学物质pH值 等)的影响.电场融合的最适条件,需要分别具体材料,在实验中不斷加以探索而提高,但电 融合因其操作简便、快速、融合同步性好,尤其是与微培养技术相结合,将会是非常有前途的 技术体系.在融合的方式上,主要有对称融合和供体-受体式融合两种.对称融合是体细胞 杂交最初采用的融合方法,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流.如在 马铃薯的育种中Mhej等用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种,开辟 了马铃薯商业化育种的新途径.但一般来说,对称融合在导入有用基因的同时,也带入新的 全部不利基因,同时在体细胞水平上,也往往表现出一定程度的种间不亲和性.供体-受体 式融合可分为细胞质杂交和不对称融合.若用致死剂量的射线处理供体原生质体,则可以 形成完全没有亲本染色体的胞质杂种,若利用ⅹ射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染 色体结构,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交,则形成不对称体细胞杂种.供体-受体 式融合,可以实现胞质基因的重组,更有希望克服远缘杂交的不亲和性,因而是一条育种的 简便途径,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程,丢失的程度是不可预见和难以 控制的所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题 2.2植物体细胞的杂交组合 20世纪70年代,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋,许多学者 直致力于用这一方法创造新的杂种在早期的研究中,研究兴趣和重点集中于获得亲缘 关系较远的植物之间的体细胞杂种,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体 融合实验.有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦( Hordeum vulgare)、大豆和玉米、大豆和油 菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜(ApⅧmgwnεol)等.多数情况下这些实验都如意料中的 样失败,融合的产物几乎不能进行分裂和生长.随后,许多学者试图从同科异属的杂种细 胞再生杂种植物杂交组合的例子有番茄+马铃薯、拟南芥+油菜、颠茄(Amp郫p.)+曼陀 罗( Datura spp.)等,且获得了一些稳定的杂种细胞品系,有的还成功地再生出属间杂种植 物,如广为宣传的番茄+马铃薯杂交植株.20世纪80年代中期以来,人们研究的兴趣转向 选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合.近缘体细胞杂交,具有更强的目的性,并 且在实践上已经证明是一条可行的育种途径.在此期间,随着一大批经济植物如水稻、大 201994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreservedhttp://wnww.cnki.net
钙高 pH 法、PEG法等 ,后来相继发展了 PEG与高 Ca2 + 、高 pH 值相结合的方法 (也简称 PEG 法) 、电融合法以及聚集微束激光法. 目前 ,广泛使用的是 PEG法和电融合法. PEG法是采用 聚乙二醇为融合剂的一种化学方法 ,使用简便、经济、可重复性强 ,已成功使近百个实验获得 体细胞杂种. PEG法诱导原生质体融合时 ,一般所用分子量为1 500～6 000 ,浓度为 15 %～ 45 %. PEG法的缺点是处理时间、PEG分子量、诱导液的浓度等不易掌握 ,且易形成多元融合 物 ,还有待于完善. 电场融合是目前最流行的物理诱导融合法 ,它是 20 世纪 80 年代初迅速 崛起的一种细胞融合技术[9 ] . 近年来 ,已发表了数百篇关于电融合的基本化学机理及其在 医学、分子生物学、生物技术学等方面应用的科学论文. 迄今为止 ,通过电融合反复实验 ,已 测出了数十种植物原生质体的电融合参数 ,如水稻、小麦、燕麦 (Avena sativa L) 、马铃薯 ( Solanum tuberousm) 、油菜( B . campestris) 、胡萝卜( Daucus carota) 、菜豆( Phaseolus vulgaris) 、蚕 豆、烟草、矮牵牛等 ,并成功获得部分细胞杂种[10 ] . 原生质体在融合液中的接触和融合受到 外电场的作用强度、融合液的组成(如渗透剂种类、Ca2 + ,Mg2 + 浓度、添加的化学物质、pH 值 等) 的影响. 电场融合的最适条件 ,需要分别具体材料 ,在实验中不断加以探索而提高 ,但电 融合因其操作简便、快速、融合同步性好 ,尤其是与微培养技术相结合 ,将会是非常有前途的 技术体系. 在融合的方式上 ,主要有对称融合和供体 - 受体式融合两种. 对称融合是体细胞 杂交最初采用的融合方法 ,并由之实现了许多有性杂交不亲和的种属间的基因交流. 如在 马铃薯的育种中 ,Mattheij 等[11 ]用对称融合的方法获得了产量提高的四倍体细胞杂种 ,开辟 了马铃薯商业化育种的新途径. 但一般来说 ,对称融合在导入有用基因的同时 ,也带入新的 全部不利基因 ,同时在体细胞水平上 ,也往往表现出一定程度的种间不亲和性. 供体 - 受体 式融合可分为细胞质杂交和不对称融合. 若用致死剂量的射线处理供体原生质体 ,则可以 形成完全没有亲本染色体的胞质杂种 ,若利用 X射线、紫外线打断或破坏亲本一方完整的染 色体结构 ,使染色体部分被破坏后用于体细胞杂交 ,则形成不对称体细胞杂种. 供体 - 受体 式融合 ,可以实现胞质基因的重组 ,更有希望克服远缘杂交的不亲和性 ,因而是一条育种的 简便途径 ,但不足之处在于供体基因丢失是一个随机的过程 ,丢失的程度是不可预见和难以 控制的 ,所以有针对地转移特定的性状是亟待解决的问题. 212 植物体细胞的杂交组合 20 世纪 70 年代 ,在培育体细胞杂种方面所取得的巨大成功使人们极度兴奋 ,许多学者 一直致力于用这一方法创造新的杂种. 在早期的研究中 ,研究兴趣和重点集中于获得亲缘 关系较远的植物之间的体细胞杂种 ,在许多系统发育上无关的种间进行了大量的原生质体 融合实验. 有关例子包括大豆和烟草、大豆和大麦( Hordeum vulgare) 、大豆和玉米、大豆和油 菜、胡萝卜和大麦、胡萝卜和芹菜 ( Apium graveolens) 等. 多数情况下这些实验都如意料中的 一样失败 ,融合的产物几乎不能进行分裂和生长. 随后 ,许多学者试图从同科异属的杂种细 胞再生杂种植物 ,杂交组合的例子有番茄 + 马铃薯、拟南芥 + 油菜、颠茄(Atropa spp. ) + 曼陀 罗( Datura spp. ) 等 ,且获得了一些稳定的杂种细胞品系 ,有的还成功地再生出属间杂种植 物 ,如广为宣传的番茄 + 马铃薯杂交植株. 20 世纪 80 年代中期以来 ,人们研究的兴趣转向 选用近缘种内或种间以及较近缘属间的杂交组合. 近缘体细胞杂交 ,具有更强的目的性 ,并 且在实践上已经证明是一条可行的育种途径. 在此期间 ,随着一大批经济植物如水稻、大 第 4 期 李 杰 ,等 :植物原生质体培养和体细胞融合技术研究进展 76 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
仲恺农业技术学院学报 第16卷 豆、小麦、柑桔(α itrs reticulata)、猕猴桃(A. chinensis)、樱桃( Pyrus anium)、杨树等原生质体培 养的成功和对部分体细胞杂种研究的重视,重要经济植物非对称体细胞杂交成为该领域研 究的主流.Zu等12、向凤宁等13先后以小麦为受体进行了一系列属间、种间非对称原生 质体细胞融合,并获得体细胞杂种植物.邓秀新等通过柑桔体细胞杂交得到抗寒、抗高温 和抗病的杂种植株.肖尊安等l5通过猕猴桃属种间原生质体融合,获得了中华猕猴桃(A ch肥nsis)与狗枣猕猴桃A. kolomikta)的4个体细胞杂种无性系再生植株.辛化伟16通过非 对称杂交,获得水稻与大黍( Panicum maximun)的体细胞杂种及后代据不完全统计通过体 细胞杂交至少已获得44个种内、103个同属异种,48个属间、5个科间的杂种植物,其中非 对称融合的体细胞杂种在90%以上 2.3杂种细胞筛选和体细胞杂种鉴定 植物原生质体融合后的杂种细胞筛选方法,迄今还没有一个在总体上可以被广泛应用 的方案。目前按其各自的基本原理可分为3类:①利用或创造各种缺陷型或抗性互补细胞 系,用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来.细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷 互补及抗性互补.前两种为隐性性状,其实施的关键是作为遗传标记的有关突变的利用将 黄化的黄花烟草(N.rsia)原生质体同白化的普通烟草原生质体融合,随后筛选出绿色的 种间体细胞杂种.抗性互补为显性性状,当两个单抗的亲本融合后产生双抗杂种细胞用 相应的选择培养基则能将杂种细胞筛选出来,如 Wilbrand等用这种方法筛选了体细胞杂 种.②利用或人为地造成两亲本原生质的物理特异性差异进行选择.如 Sunder等8根据 融合和未融合原生质体物理特性的差异,利用倒置显微镜成功挑选出油菜融合原生质体, Chng等以用荧光激活细胞分拣机FACS实现了大量挑选杂种细胞.③利用或人为地造成 细胞生长或分化能力的差异进行选择.向凤宁等在小麦与3种近缘属间禾草的体细胞杂 交中发现,融合克隆具有优先生长的现象,这种生长速度的差异可用作选择的依据 当由杂种细胞获得再生植株后,必须进一步的分析和鉴定以证实杂种的真实性.常用 的杂种鉴定方法有表现型鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定及分子生物学鉴定.表现性鉴定是 最常用的方法,是利用杂种与双亲表现型的差异进行比较分析.这种差异可以是形态学的 直接特征,也可以是通过转基因人为创造的抗逆性.染色体数目和形态具有种的特性,是鉴 定杂种的主要细胞学证据此外基因组原位杂交(GSH)是分子细胞学鉴定杂种的主要方 法.如 Zhining等2利用GSH确认了羊草(L. chinensis)和小麦体细胞杂种.同工酶分析是 最基本的生化分析方法,杂种的同工酶谱往往是双亲酶谱的总和,同时表现双亲特有的酶 谱,也可能出现双亲没有的新酶带.有学者成功地通过分析油菜的PG、P(M等同工酶,鉴定 了体细胞杂种.近年来,对融合杂种植株进行分子生物学鉴定己成为强有力的手段.常用 的鉴定植物体细胞杂种的分子生物学方法有限制性片段长度多态性( Restriction fragment length ployprphism,RHP)、随机扩增多态性( Random amplified polymorphic DNA,RAP)、扩增 片段长度多态性( Amplified fragment length ploymrphism,AHP)、简单重复序列( Simple se- quence repent,SSR)等.在这方面已经有较多成功的例子 01994-2008ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.alrightsreservedhttp://ww.cnki.ne
豆、小麦、柑桔( Citrus reticulata) 、猕猴桃( A. chinensis) 、樱桃( Pyrus avium) 、杨树等原生质体培 养的成功和对部分体细胞杂种研究的重视 ,重要经济植物非对称体细胞杂交成为该领域研 究的主流. Zhou 等[12 ] 、向凤宁等[13 ]先后以小麦为受体进行了一系列属间、种间非对称原生 质体细胞融合 ,并获得体细胞杂种植物. 邓秀新等[14 ]通过柑桔体细胞杂交得到抗寒、抗高温 和抗病的杂种植株. 肖尊安等[15 ]通过猕猴桃属种间原生质体融合 ,获得了中华猕猴桃 (A. chinensis) 与狗枣猕猴桃( A. kolomikta) 的 4 个体细胞杂种无性系再生植株. 辛化伟[16 ]通过非 对称杂交 ,获得水稻与大黍( Panicum maximum) 的体细胞杂种及后代. 据不完全统计 ,通过体 细胞杂交 ,至少已获得 44 个种内、103 个同属异种 ,48 个属间、5 个科间的杂种植物 ,其中非 对称融合的体细胞杂种在 90 %以上. 213 杂种细胞筛选和体细胞杂种鉴定 植物原生质体融合后的杂种细胞筛选方法 ,迄今还没有一个在总体上可以被广泛应用 的方案. 目前按其各自的基本原理可分为 3 类 : ①利用或创造各种缺陷型或抗性互补细胞 系 ,用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来. 细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷 互补及抗性互补. 前两种为隐性性状 ,其实施的关键是作为遗传标记的有关突变的利用. 将 黄化的黄花烟草( N. rustica) 原生质体同白化的普通烟草原生质体融合 ,随后筛选出绿色的 种间体细胞杂种[6 ] . 抗性互补为显性性状 ,当两个单抗的亲本融合后产生双抗杂种细胞 ,用 相应的选择培养基则能将杂种细胞筛选出来 ,如 Wijbrandi 等[17 ]用这种方法筛选了体细胞杂 种. ②利用或人为地造成两亲本原生质的物理特异性差异进行选择. 如 Sundber 等[18 ]根据 融合和未融合原生质体物理特性的差异 ,利用倒置显微镜成功挑选出油菜融合原生质体 , Chuong 等[19 ]用荧光激活细胞分拣机 FACS 实现了大量挑选杂种细胞. ③利用或人为地造成 细胞生长或分化能力的差异进行选择. 向凤宁等[20 ]在小麦与 3 种近缘属间禾草的体细胞杂 交中发现 ,融合克隆具有优先生长的现象 ,这种生长速度的差异可用作选择的依据. 当由杂种细胞获得再生植株后 ,必须进一步的分析和鉴定以证实杂种的真实性. 常用 的杂种鉴定方法有表现型鉴定、细胞学鉴定、同工酶鉴定及分子生物学鉴定. 表现性鉴定是 最常用的方法 ,是利用杂种与双亲表现型的差异进行比较分析. 这种差异可以是形态学的 直接特征 ,也可以是通过转基因人为创造的抗逆性. 染色体数目和形态具有种的特性 ,是鉴 定杂种的主要细胞学证据. 此外基因组原位杂交 ( GISH) 是分子细胞学鉴定杂种的主要方 法. 如 Zhining 等[21 ]利用 GISH 确认了羊草(L . chinensis) 和小麦体细胞杂种. 同工酶分析是 最基本的生化分析方法 ,杂种的同工酶谱往往是双亲酶谱的总和 ,同时表现双亲特有的酶 谱 ,也可能出现双亲没有的新酶带. 有学者成功地通过分析油菜的 PGI、PGM 等同工酶 ,鉴定 了体细胞杂种[7 ] . 近年来 ,对融合杂种植株进行分子生物学鉴定己成为强有力的手段. 常用 的鉴定植物体细胞杂种的分子生物学方法有限制性片段长度多态性 (Restriction fragment length ploymorphism , RFLP) 、随机扩增多态性(Random amplified polymorphic DNA , RAPD) 、扩增 片段长度多态性 (Amplified fragment length ploymorphism , AFLP) 、简单重复序列 (Simple se2 quence repent , SSR) 等. 在这方面已经有较多成功的例子. 86 仲恺农业技术学院学报 第 16 卷 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net