选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀,而不影 响所需的酶,从而使酶与杂质分离 31盐析沉淀法 盐析沉淀法简称盐析法,是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特 性,通过在酶液中添加一定浓度的中性盐,使酶或杂质从溶液中析岀沉淀,从而使酶与杂质 分离的过程。盐 蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响 ◆—般在低盐浓度的情况下,蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加,这种现象称为盐 溶。 ◆而在盐浓度升高到一定浓度后,蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低,结果使蛋 白质沉淀析出,这种现象称为盐析 ◆盐之所以会改变蛋白质的溶解度,是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反 离子作用,使蛋白质分子表面的电荷改变,同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度,使 分子表面的水化膜改变 ◆酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。它们之间的关系可用下式表示 -K. 式中,S:酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度(g/L) S0:酶或蛋白质在离子强度为0时(即在纯溶剂中)的溶解度(g/) K:盐析系数 I:离子强度 6
6 选择性变性沉淀法 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影 响所需的酶，从而使酶与杂质分离 3.1 盐析沉淀法 ◆盐析沉淀法简称盐析法，是利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特 性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质 分离的过程。盐 蛋白质在水中的溶解度受到溶液中盐浓度的影响。 ◆一般在低盐浓度的情况下，蛋白质的溶解度随盐浓度的升高而增加，这种现象称为盐 溶。 ◆而在盐浓度升高到一定浓度后，蛋白质的溶解度又随盐浓度的升高而降低，结果使蛋 白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 ◆盐之所以会改变蛋白质的溶解度，是由于盐在溶液中离解为正离子和负离子。由于反 离子作用，使蛋白质分子表面的电荷改变，同时由于离子的存在改变了溶液中水的活度，使 分子表面的水化膜改变。 ◆酶在溶液中的溶解度与溶液的离子强度关系密切。它们之间的关系可用下式表示： S Log ＝ - KsI S0 式中， S：酶或蛋白质在离子强度为 I 时的溶解度（g/L） S0：酶或蛋白质在离子强度为 0 时（即在纯溶剂中）的溶解度（g/L） Ks：盐析系数 I：离子强度
在温度和pH值一定的条件下,S为一常数。所以上式可以改写为 LogS=LogS0-Ks=β-Ksf 式中,β= LogO,主要决定于酶或蛋白质的性质,也与温度和pH值有关。当温度和 pH值一定时,β为一常数。 Ks为盐析系数,主要决定于盐的性质。Ks的大小与离子价数成正比、与离子半 径和溶液的介电常数成反比,也与酶或蛋白质的结构有关。 ◆窝子强度I是指溶液中离子强弱的程度,与离子浓度和离子价数有关。即: ∑mZ 式中,m:离子强度(mo/L) z;:离子价数 ◆对于含有多种酶或蛋白质的混合液,可以采用分段盐析的方法进行分离纯化 °在一定的温度和pH值条件下(β为常数),通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质 分离的方法称为Ks分段盐析; 而在一定的盐和离子强度的条件下(K为常数),通过改变温度和pH值,使不同的 酶或蛋白质分离的方法,称为β分段盐析。 ◆在蛋白质的盐析中,通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠 和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。 ◆在盐析时,溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。饱和度是指溶液中加入的饱和硫 酸铵的体积与混合溶液总体积之比值
7 在温度和 pH 值一定的条件下，S0为一常数。所以上式可以改写为： LogS = LogS0 - KsI = β- KsI 式中，β= LogS0， 主要决定于酶或蛋白质的性质，也与温度和 pH 值有关。当温度和 pH 值一定时，β为一常数。 Ks为盐析系数，主要决定于盐的性质。Ks的大小与离子价数成正比、与离子半 径和溶液的介电常数成反比，也与酶或蛋白质的结构有关。 ◆离子强度 I 是指溶液中离子强弱的程度，与离子浓度和离子价数有关。即： 1 I = — ∑miZi 2 式中， mi ：离子强度（mol/L） Zi： 离子价数 2 ◆对于含有多种酶或蛋白质的混合液，可以采用分段盐析的方法进行分离纯化。 ◇在一定的温度和 pH 值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质 分离的方法称为 Ks分段盐析； ◇而在一定的盐和离子强度的条件下（KsI 为常数），通过改变温度和 pH 值，使不同的 酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。 ◆在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠 和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。 ◆在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。饱和度是指溶液中加入的饱和硫 酸铵的体积与混合溶液总体积之比值
3.2等电点沉淀法 ◆利用两性电解质在等电点时溶解度最低,以及不同的两性电解质有不同的等电点这 特性,通过调节溶液的pH值,使酶或杂质沉淀析岀,从而使酶与杂质分离的方法称为等电 ◆由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在在实际使用时,等电点沉淀法 往往与其它方法一起使用。 ◆在加酸或加碱调节pH值的过程中,要-边搅拌边慢慢加进,以防止局部过酸或过 碱而引起的酶变性失活。 33有机溶剂沉淀法 ◆利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同,通过添加一定量的某种有机溶剂,使 酶或杂质沉淀析岀,从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。 ◆有机溶剂之所以能使酶沉淀析岀是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。 常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂的用量一 般为酶液体积的2倍左右,不同的酶和使用不同的有机溶剂时,有机溶剂的使用浓度有所 不同 ◆有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液pH值的影响,一般应将酶液的ρH值调节到欲 分离酶的等电点附近。 34复合沉淀法 ◆在酶液中加入某些物质,使它与酶形成复合物而沉淀下来,从而使酶与杂质分离的方 法称为复合沉淀法 ◆常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物 3.5选择性变性沉淀法
8 3.2 等电点沉淀法 ◆利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一 特性，通过调节溶液的 pH 值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为等电 点沉淀法。 ◆由于在等电点时两性电解质分子表面的水化膜仍然存在,在实际使用时，等电点沉淀法 往往与其它方法一起使用。 ◆在加酸或加碱调节 pH 值的过程中， 要一边搅拌一边慢慢加进，以防止局部过酸或过 碱而引起的酶变性失活。 3.3 有机溶剂沉淀法 ◆利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使 酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法称为有机溶剂沉淀法。 ◆有机溶剂之所以能使酶沉淀析出是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。 ◆常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。有机溶剂的用量一 般为酶液体积的 2 倍左右，不同的酶和使用不同的有机溶剂时，有机溶剂的使用浓度有所 不同。 ◆有机溶剂沉淀法的分离效果受到溶液 pH 值的影响，一般应将酶液的 pH 值调节到欲 分离酶的等电点附近。 3.4 复合沉淀法 ◆在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的方 法称为复合沉淀法。 ◆常用的复合沉淀剂有单宁、聚乙二醇、聚丙烯酸等高分子聚合物。 3.5 选择性变性沉淀法
◆选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀,而不影响所需的酶,这 种分离方法称为选择性变性沉淀法。 ◆根据酶和所含杂质的特性,通过加热或改变pH值或加进某些金属离子等使杂蛋白变 性沉淀而除去。 ◆在应用该法之前,必须对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类,含量及其物 理、化学性质有比较全面的了解。 4离心分离 ◆窝心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力,使不同大小、不同密度的物质分离的技术 ◆在离心分离时,要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同,选择适当的 离心机、离心方法和窝心条件 41离心机的选择 ◆窝心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类,可以分为常速(低速)离心机、 高速离心机和超速离心机3种。 ◇常速离心机(低速离心机):最大转速在8000r/min以内,相对离心力(RCF)在1 104×g以下。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于的结晶 等较大颗粒的分离。 ◇高速离心机(设有冷冻装置):最大转速为(1~25)×104r/min,相对离心力达 到1×104~1×105×g。主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。 超速离心机:最大转速达(25~12)×104r/min,相对离心力可以高达5×105×g甚 至更高。主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化; 样品纯度的检测;沉降系数和相对分子质量的测定等
9 ◆选择一定的条件使酶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，这 种分离方法称为选择性变性沉淀法。 ◆根据酶和所含杂质的特性，通过加热或改变 pH 值或加进某些金属离子等使杂蛋白变 性沉淀而除去。 ◆在应用该法之前，必须对欲分离的酶以及酶液中的杂蛋白等杂质的种类，含量及其物 理、化学性质有比较全面的了解。 4.离心分离 ◆离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术 过程。 ◆在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的 离心机、离心方法和离心条件。 4.1 离心机的选择 ◆离心机通常按照离心机的最大转速的不同进行分类，可以分为常速（低速）离心机、 高速离心机和超速离心机 3 种。 ◇常速离心机（低速离心机）：最大转速在 8000 r/min 以内，相对离心力（RCF）在 1 ×104× g 以下。主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的结晶 等较大颗粒的分离。 ◇高速离心机（设有冷冻装置）：最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力达 到 1×104～1×105 ×g 。主要用于沉淀、细胞碎片和细胞器等的分离。 ◇超速离心机：最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105× g 甚 至更高。主要用于 DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化； 样品纯度的检测；沉降系数和相对分子质量的测定等
4.2离心方法的选用 ◆对于常速离心机和高速离心机,由于所分离的颗粒大小和密度相差较大,只要选择好 离心速度和离心时间,就能达到分离效果 ◆如果希望从样品液中分离出2种以上大小和密度不同的颗粒需要采用差速离心方法。 而对于超速离心,则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方 法。 4.21差速离心 ◆差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间,使不同沉降速度的颗粒分批分离的方 42.2密度梯度离心: 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心,使沉降系数比较接近的物质分离的 种区带分离方法 ◆为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离,必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯 度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。 ◆常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统,其适用范围是 蔗糖浓度5~60%,密度范围1.02~1.30g/cm2。 ◆密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。制备得到的密度梯度可以分为线性梯 度、凹形梯度和凸形梯度等(图4-1) 密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成,如图4-2所示。 B A
10 4.2 离心方法的选用 ◆对于常速离心机和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好 离心速度和离心时间，就能达到分离效果； ◆如果希望从样品液中分离出 2 种以上大小和密度不同的颗粒，需要采用差速离心方法。 ◆而对于超速离心，则可以根据需要采用差速离心、密度梯度离心或等密梯度离心等方 法。 4.2.1 差速离心： ◆差速离心是指采用不同的离心速度和离心时间，使不同沉降速度的颗粒分批分离的方 法。 4.2.2 密度梯度离心： ◆密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质分离的 一种区带分离方法。 ◆为了使沉降系数比较接近的颗粒得以分离，必须配制好适宜的密度梯度系统。密度梯 度系统是在溶剂中加入一定的溶质制成的。这种溶质称为梯度介质。 ◆常用的梯度介质有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系统，其适用范围是： 蔗糖浓度 5～60%，密度范围 1.02～1.30 g/cm2。 ◆密度梯度一般采用密度梯度混合器进行制备。制备得到的密度梯度可以分为线性梯 度、凹形梯度和凸形梯度等(图 4-1)。 ◆密度梯度混合器由贮液室、混合室、电磁搅拌器和阀门等组成，如图 4-2 所示。 B A B A B A