2、DNA连接酶每 DNA连接酶是重组DNA分子构建必 不可少的工具酶,能催化DNA中相邻 的3-0H和5-磷酸基末端之间形成 磷酸二酯键并把两段DNA连接起来
2、DNA连接酶 DNA连接酶是重组DNA分子构建必 不可少的工具酶，能催化DNA中相邻 的3’ –OH和5’ – 磷酸基末端之间形成 磷酸二酯键并把两段DNA连接起来
mRNA 3、反转录酶 PoyA尾巴 3AAAAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT 5 加入 poly-dT引物 反转录酶是 AAAAA 类以RNA为模 TTTT 加入逆转录酶 板來指导DNA AAAAA T 合成的DNA聚计复 DNA合成继续 合酶,故又称 AAAAA 依赖于RNA的 消化RNA DNA聚合酶每 单链cDNA TTTTT Immi 通常用反转录 加入DNA聚合酶I 酶构建cDNA TTTTT AAAA 文库(CDNA 加入S核酸酶,去除发夹结构 library) 5 TTTTT. 3'AAAA
3、反转录酶 反转录酶是一 类以RNA为模 板来指导DNA 合成的DNA聚 合酶，故又称 依赖于RNA的 DNA聚合酶 通常用反转录 酶构建cDNA 文库（cDNA library）
4、聚合酶链式反应(PCR PCR是体外快扩增DNA的方法,由美国的 Mu1lis(1986)发明,1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段选行扩增,且可用痕量 DNA作模板。对DNA纯度要求也不高,可在几 小时内使目的基因片段扩增到教百万个拷贝 PCR反应在一种混合液中进行。该混合液包 括四种主要成分:两个引物(一般为20bp )、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶(Taq酶 在95℃甚至更高的温度下活性稳定)和四 种脱氧校苷酸。PCR反应在PCR仪上自动选行
4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的 Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增，且可用痕量 DNA作模板，对DNA纯度要求也不高,可在几 小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝 PCR反应在一种混合液中进行，该混合液包 括四种主要成分：两个引物（一般为20 bp ）、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶（Taq酶 ，在95℃甚至更高的温度下活性稳定）和四 种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行
PCR反应从启动到结束称为一个循环。每个 循环包括三个步骤: 1)变性:95℃,DNA Cycle 1 引物退火 双链分高成单链 2 copies 2)退火(复性):55℃ 互补链分开,引物退火 >新链 左右,引物与单链的 Cycle 2 聚合酶作用下引物延伸 模板DNA序列互补结合 4copies 3)延伸:72℃左右, 互补链分开 引物退火 Taq酶通过在引物 引物延伸 Cycle 3 的33-0H嘴增加碱基的 办法使引物延伸
PCR反应从启动到结束称为一个循环，每个 循环包括三个步骤： 1）变性：95℃，DNA 双链分离成单链 2）退火(复性)：55℃ 左右，引物与单链的 模板DNA序列互补结合 3）延伸：72℃左右， Taq酶通过在引物 的3’-OH端增加碱基的 办法使引物延伸
表12-2PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系 循环数 PCR产物拷贝数 2 25 32 10 2 10 1024 15 915 32768 20 20 1048576 25 222 25 33554432 30 30 1073741824 b12345678910
表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系 循环数 PCR产物拷贝数 1 2 1 2 5 2 5 32 10 2 10 1024 15 2 15 32768 20 2 20 1048576 25 2 25 33554432 30 2 30 1073741824