动物微生物实验实训指导书 一、实验实训指导说明： 1、性质与作用：动物微生物是高等农业职业院校畜牧兽医专业的一门岗位素质课 程。对应岗位是：动物疫病诊断、检疫、检测技术等实训室技术岗位。作用是：研究微 生物与畜禽的关系，并利用微生物学与免疫学的知识和技能来诊断、防治畜禽的疾病与 人畜共患疾病，让学生具备畜牧兽医行业高等技术应用型专门人才所必须的畜禽疾病诊 断、检测、预防等专业知识和熟练的职业专门技术能力，培养学生具备相应职业关键技 术能力和职业道德。在教学过程中，使学生要掌握动物微生物与免疫所必须的专项实践 技能和综合职业能力，基本掌握细菌类疾病、病毒类疾病、其他微生物实训室检验技术 等。同时，在教学中对学生职业道德进行影响，注意敬业精神、吃苦耐劳、尽心钻研等 方面的教育影响，并形成良好职业道德和敬业精神。 2、课程内涵：本课程的内涵是通过过程性的训练及考核，通过形成性联系及渐进 式教学，使学生不但掌握专业知识而且能够有效把握技能的知识背景及相应的产业历 史，为学生在系统掌握本课程专业技能操作的同时，初步具有应对复杂问题及进行有效 迁移以及创造的能力。使学生掌握动物微生物课程所必须的专业理论知识，专业实践能 力和综合职业能力，掌握主要动物的疾病实训室诊断技术，可以独立的开展动物疫病的 实训室检验，具有较强的工作岗位适应能力、分析和解决实际问题的能力以及创新意识 和职业道德意识。经过本课程的学习及培养后学生应具有认真负责、踏实肯干，严谨求 实的工作态度及独立思考、自主创业的精神。 二、实验实训目录： 实验实训一 显微镜油镜的使用及细菌形态观察方法 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 实验实训三 细菌标本片的制备及染色方法 实验实训四 常用培养基的制备 实验实训五 细菌的分离培养及培养性状的观察技术 实验实训六 细菌的药物敏感试验（纸片法）技术 实验实训七 外界环境微生物测定技术 实验实训八 实验动物接种技术 实验实训九 病毒鸡胚接种技术 实验实训十 鸡新城疫病毒的红细胞（血）凝集与凝集抑制试验（微量法）操作技 术 实验实训十一 真菌的检验技术 实验实训十二 凝集试验 实验实训十三 琼脂扩散试验技术
动物微生物实验实训指导书 一、实验实训指导说明： 1、性质与作用：动物微生物是高等农业职业院校畜牧兽医专业的一门岗位素质课 程。对应岗位是：动物疫病诊断、检疫、检测技术等实训室技术岗位。作用是：研究微 生物与畜禽的关系，并利用微生物学与免疫学的知识和技能来诊断、防治畜禽的疾病与 人畜共患疾病，让学生具备畜牧兽医行业高等技术应用型专门人才所必须的畜禽疾病诊 断、检测、预防等专业知识和熟练的职业专门技术能力，培养学生具备相应职业关键技 术能力和职业道德。在教学过程中，使学生要掌握动物微生物与免疫所必须的专项实践 技能和综合职业能力，基本掌握细菌类疾病、病毒类疾病、其他微生物实训室检验技术 等。同时，在教学中对学生职业道德进行影响，注意敬业精神、吃苦耐劳、尽心钻研等 方面的教育影响，并形成良好职业道德和敬业精神。 2、课程内涵：本课程的内涵是通过过程性的训练及考核，通过形成性联系及渐进 式教学，使学生不但掌握专业知识而且能够有效把握技能的知识背景及相应的产业历 史，为学生在系统掌握本课程专业技能操作的同时，初步具有应对复杂问题及进行有效 迁移以及创造的能力。使学生掌握动物微生物课程所必须的专业理论知识，专业实践能 力和综合职业能力，掌握主要动物的疾病实训室诊断技术，可以独立的开展动物疫病的 实训室检验，具有较强的工作岗位适应能力、分析和解决实际问题的能力以及创新意识 和职业道德意识。经过本课程的学习及培养后学生应具有认真负责、踏实肯干，严谨求 实的工作态度及独立思考、自主创业的精神。 二、实验实训目录： 实验实训一 显微镜油镜的使用及细菌形态观察方法 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 实验实训三 细菌标本片的制备及染色方法 实验实训四 常用培养基的制备 实验实训五 细菌的分离培养及培养性状的观察技术 实验实训六 细菌的药物敏感试验（纸片法）技术 实验实训七 外界环境微生物测定技术 实验实训八 实验动物接种技术 实验实训九 病毒鸡胚接种技术 实验实训十 鸡新城疫病毒的红细胞（血）凝集与凝集抑制试验（微量法）操作技 术 实验实训十一 真菌的检验技术 实验实训十二 凝集试验 实验实训十三 琼脂扩散试验技术
三、实践教学内容： 实验实训一显微镜油镜的使用及细菌形态的观察 一、目的要求： 1、要求学生掌握显微镜油镜的使用及保养方法。 2、认识细菌的形态、基本构造和特殊构造 二、设备材料： 显微镜香柏油二甲苯擦镜纸细菌染色标本 三、实验实训内容： (一)显微镜油镜的使用 1、油镜的识别：油镜是显微镜物镜的一种，因使用时必须浸于香柏油内，故称油镜。 油镜与其他物镜有以下区别： (1)油镜一般是所有物镜中最长的。 (2)油镜头上标有其放大倍数“100×”或“90×”。 (3)不同厂家生产的显微镜，常在不同镜头上标有不同颜色的线圈以示区别，使用时应 先熟悉一下油镜头上的线圈颜色，以防用错物镜。 2、基本原理：因光线在香柏油中的折射率(n=1.515)与在玻璃中的折射率(n=1.52》 相近，故可减少因折射而射入镜头外的光线，提高了视野的亮度。 3、使用方法： (1)对光：将聚光器升至最高，将光圈放大至最大，调节凹面反光镜，使射入镜头中 的光线最强。 (2)装片：在细菌染色标本片的欲检部位滴一滴香柏油后，将标本片安放于载物台上， 用弹簧片固定，将待检部位移至聚光器上，先用低倍镜寻找适当的视野，再换用油镜头 观察。 (3)调焦：先用粗调节螺旋将载物台上升或使油镜头下降，使油镜头与标本片几乎接 触，然后，边用眼睛观察目镜，边用细调节螺旋向相反方向缓慢旋转，直至出现完全清 晰的物像为止。 (4)保养：油镜用毕，先用粗调节螺旋将载物台下移或使油镜头上升，将细菌标本片 取下，用擦镜纸吸去香柏油，如油已干或模糊不清者，可在擦镜纸上滴1一2滴二甲苯 或无水乙醇后将玻片上的香柏油吸净，并立即用干擦镜纸拭去二甲苯：用同样的方法将 油镜头擦拭干净。然后将低倍镜转至中央或将物镜转成“八”字形，调节粗调节螺旋
三、实践教学内容： 实验实训一 显微镜油镜的使用及细菌形态的观察 一、目的要求： 1、要求学生掌握显微镜油镜的使用及保养方法。 2、认识细菌的形态、基本构造和特殊构造。 二、设备材料： 显微镜 香柏油 二甲苯 擦镜纸 细菌染色标本 三、实验实训内容： （一）显微镜油镜的使用 1、油镜的识别：油镜是显微镜物镜的一种，因使用时必须浸于香柏油内，故称油镜。 油镜与其他物镜有以下区别： （1）油镜一般是所有物镜中最长的。 （2）油镜头上标有其放大倍数 “100×” 或“90×”。 （3）不同厂家生产的显微镜,常在不同镜头上标有不同颜色的线圈以示区别，使用时应 先熟悉一下油镜头上的线圈颜色,以防用错物镜。 2、基本原理：因光线在香柏油中的折射率（n=1.515）与在玻璃中的折射率（n=1.52） 相近，故可减少因折射而射入镜头外的光线，提高了视野的亮度。 3、使用方法： （1）对光：将聚光器升至最高，将光圈放大至最大，调节凹面反光镜，使射入镜头中 的光线最强。 （2）装片：在细菌染色标本片的欲检部位滴一滴香柏油后，将标本片安放于载物台上， 用弹簧片固定，将待检部位移至聚光器上，先用低倍镜寻找适当的视野，再换用油镜头 观察。 （3）调焦：先用粗调节螺旋将载物台上升或使油镜头下降，使油镜头与标本片几乎接 触，然后，边用眼睛观察目镜，边用细调节螺旋向相反方向缓慢旋转，直至出现完全清 晰的物像为止。 （4）保养：油镜用毕，先用粗调节螺旋将载物台下移或使油镜头上升，将细菌标本片 取下，用擦镜纸吸去香柏油，如油已干或模糊不清者，可在擦镜纸上滴 1－2 滴二甲苯 或无水乙醇后将玻片上的香柏油吸净，并立即用干擦镜纸拭去二甲苯；用同样的方法将 油镜头擦拭干净。然后将低倍镜转至中央或将物镜转成“八”字形，调节粗调节螺旋
使物镜头与载物台接触，下降聚光器。将显微镜用绸布盖好后装入镜箱，置于阴凉干燥 外。 (二)细菌形态的观察： 1、细菌基本形态的观察： 2、细菌特殊构造的观察： (1)球菌标本片的观察 (1)细菌荚膜标本片的观察 (2)杆菌标本片的观察 (2)细菌鞭毛标本片的观察 (3)螺旋菌标本片的观察 (3)细菌芽孢标本片的观察 注意事项： 1、当油镜头与标本片几乎接触时，不可再用粗调螺旋向上移动载物台或下降油镜头， 以免损坏玻片甚至压碎镜头。 2、油镜头和玻片只能用擦镜纸擦拭，不能用手、棉布或其他纸张擦拭。 3、香柏油的用量以1一2滴、能淹到油镜头的中间部分为宜，用量太多则浸染镜头，太 少则视野变暗不便观察。 4、为了增强视野的亮度，应做到三点：聚光器调至最高，光圈调至最大，反光镜用凹 面镜。 四、教学组织：实验1人一组，每人有一台显微镜，教师认真讲解操作规程，边讲解边 示范，学生观察做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将细菌形态画于实验册上。 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 一、目的要求：掌握动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 二、设备材料：试管吸管平皿三角烧瓶烧杯量筒脱脂棉纱布旧报纸石 炭酸洗衣粉盐酸等 三、实验实训内容 玻璃器皿的准备 1、购置的载片，先用2%盐酸浸泡一天，冲去盐酸。再用洗衣粉水洗涤，用自来水冲净， 浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。 2、用过的玻璃器皿的处理： &洗涤前必须灭菌：高压灭菌：油类的物品乘热洗涤（培养基、血液试管滴管等）。吸 管：浸泡于5%石炭酸48H。&洗涤 ※用过的载片，先用纸擦去香柏油，再放入洗衣粉液中煮沸（或5%的石炭酸48H浸泡）， 稍冷后取出。逐个用清水洗净，放于酒精中。试管等物品同灭菌及洗涤。 ※盖片使用前，可用洗衣粉或洗液浸泡，洗净后再用95%乙醇浸泡，擦干备用，用过的 盖片也应及时洗净擦干保存
使物镜头与载物台接触，下降聚光器。将显微镜用绸布盖好后装入镜箱，置于阴凉干燥 处。 （二）细菌形态的观察： 1、细菌基本形态的观察： 2、细菌特殊构造的观察： （1）球菌标本片的观察 （1）细菌荚膜标本片的观察 （2）杆菌标本片的观察 （2）细菌鞭毛标本片的观察 （3）螺旋菌标本片的观察 （3）细菌芽孢标本片的观察 注意事项： 1、当油镜头与标本片几乎接触时，不可再用粗调螺旋向上移动载物台或下降油镜头， 以免损坏玻片甚至压碎镜头。 2、油镜头和玻片只能用擦镜纸擦拭，不能用手、棉布或其他纸张擦拭。 3、香柏油的用量以 1－2 滴、能淹到油镜头的中间部分为宜，用量太多则浸染镜头，太 少则视野变暗不便观察。 4、为了增强视野的亮度，应做到三点：聚光器调至最高，光圈调至最大，反光镜用凹 面镜。 四、教学组织：实验 1 人一组，每人有一台显微镜，教师认真讲解操作规程，边讲解边 示范，学生观察做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将细菌形态画于实验册上。 实验实训二 动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 一、目的要求：掌握动物微生物检验中常用玻璃器皿的准备 二、设备材料：试管 吸管 平皿 三角烧瓶 烧杯 量筒 脱脂棉 纱布 旧报纸 石 炭酸 洗衣粉 盐酸等 三、实验实训内容： 玻璃器皿的准备 1、购置的载片，先用 2%盐酸浸泡一天，冲去盐酸。再用洗衣粉水洗涤，用自来水冲净， 浸泡在蒸馏水中或擦干装盒备用。 2、用过的玻璃器皿的处理： ＆洗涤前必须灭菌：高压灭菌：油类的物品乘热洗涤（培养基、血液试管滴管等）。吸 管：浸泡于 5%石炭酸 48H。＆洗涤： ※ 用过的载片，先用纸擦去香柏油，再放入洗衣粉液中煮沸（或 5%的石炭酸 48H 浸泡）， 稍冷后取出。逐个用清水洗净，放于酒精中。试管等物品同灭菌及洗涤。 ※盖片使用前，可用洗衣粉或洗液浸泡，洗净后再用 95%乙醇浸泡，擦干备用，用过的 盖片也应及时洗净擦干保存
※吸管浸泡于洗衣粉水中，用细铁丝取出棉花，用试管刷洗涤，再用自来水洗，用蒸馏 水冲洗。 &干燥：自然干燥或干燥箱。 &包装：※棉塞的制备※试管的包装※平皿的包装。※锥形瓶的包装。 四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解 操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训三细菌标本片的制备及染色方法 一、目的要求： 要求学生掌握细菌标本片的制备基染色方法。 二、设备材料： 病料细菌培养物接种环玻片酒精灯染色缸染色架染色液 三、实验实训内容： (一)细菌涂片的制备 1、液体培养物及液体病料： (1)涂片用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小 的薄层。 (2)干燥一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30一40cm处适当加 热干燥。 (3)固定分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上， 以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度：化学固定时， 可将干燥好的玻片浸入甲醇中2一3mi后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用 2-3min后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂：作瑞特氏染色的涂 片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。 (4)染色根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。 2、固体培养物：用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央，用接种环挑取一个菌落于生 理盐水中混合，均匀地涂布成适当大小的薄层，干燥，固定，染色。 (二)细菌触片的制备：将固体病料（病变组织）作无菌切开，用切面在玻片中央接触 一下或稍用力印压成一薄层，干燥，固定，染色 (三)细菌的染色法： 1、单染色法：又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。 (1)美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液，染色1 -2min后，水洗，干燥（吸水纸吸干或自然干燥），镜检
※吸管浸泡于洗衣粉水中，用细铁丝取出棉花，用试管刷洗涤，再用自来水洗，用蒸馏 水冲洗。 ＆干燥：自然干燥或干燥箱。 ＆包装：※棉塞的制备※试管的包装※平皿的包装。※锥形瓶的包装。 四、教学组织：实验 2-3 人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生理解、 操作，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。 实验实训三 细菌标本片的制备及染色方法 一、目的要求： 要求学生掌握细菌标本片的制备基染色方法。 二、设备材料： 病料 细菌培养物 接种环 玻片 酒精灯 染色缸 染色架 染色液 三、实验实训内容： （一）细菌涂片的制备： 1、液体培养物及液体病料： （1）涂片 用接种环取一滴培养液或液体病料，于玻片的中央均匀地涂布成适当大小 的薄层。 （2）干燥 一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方 30－40cm 处适当加 热干燥。 （3）固定 分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的玻片涂面朝上， 以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背 为度；化学固定时， 可将干燥好的玻片浸入甲醇中 2－3min 后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用 2－3min 后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂；作瑞特氏染色的涂 片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。 （4）染色 根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。 2、固体培养物：用接种环取一滴生理盐水于玻片的中央, 用接种环挑取一个菌落于生 理盐水中混合,均匀地涂布成适当大小的薄层,干燥,固定,染色。 （二）细菌触片的制备： 将固体病料（病变组织）作无菌切开,用切面在玻片中央接触 一下或稍用力印压成一薄层,干燥,固定,染色。 （三）细菌的染色法： 1、单染色法：又称简单染色法，即只应用一种染料进行染色的方法。 （1）美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液，染色 1 －2min 后，水洗，干燥（吸水纸吸干或自然干燥），镜检
(2)瑞特氏染色：在己干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥 可适当多加一些，或视情况补充滴加，1一3mi后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲 液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经3一5min后，直接用水冲洗，吸干或 烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞 特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不千，3-5min后直接用水冲洗， 吸干或烘干后镜检。 (3)吉姆萨氏染色法：先将吉姆萨染色液原液稀释成常用的吉姆萨染色液（取5一10 滴原液于5l新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀)，在经甲醇固定好的涂片上滴加足量 的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30mi或浸染数小时至24小时 后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。 2、复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。 (1)革兰氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染 色1-2min后，水洗，再加革兰氏碘液，作用1-2min后，水洗，加95%酒精脱色 0.5-lmin后，水洗，稀释石炭酸复红（或沙黄、番红）染色液复染0.5min后，水 洗，干燥，镜检。 (2)抗酸染色法：常用的有萋一尼氏染色法和沙黄一美蓝染色法。 ①萋一尼氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精 灯火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持3一5mi,水洗：再用3%盐酸酒精脱色至无染色 液流出，充分水洗：然后用碱性美蓝染液复染约1mi,水洗，吸干，镜检。 ②沙黄一美蓝染色法：在己干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯 火焰上方微微加热使冒蒸气3-5次，维持1一2in,水洗：再用再用3%盐酸酒精脱色 至无染色液流出，充分水洗：然后用碱性美蓝染液复染约lmi,水洗，吸干，镜检。 注意事项： 1、做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。 2、固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。 3、每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应 随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。 4、每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。 四、教学组织：实验2-3人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作、 观察、做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将每组涂片结果画于实验册上。 实验实训四 常用培养基的制备 一、目的要求：
（2）瑞特氏染色：在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加瑞特氏染色液，为避免干燥， 可适当多加一些，或视情况补充滴加，1－3min 后再加与染液等量的中性蒸馏水或缓冲 液，轻轻晃动玻片，使之与染色液混合均匀，再经 3－5min 后，直接用水冲洗，吸干或 烘干后镜检。也可在玻片上的涂抹处盖一适当大小的滤纸，然后再在滤纸上轻轻滴加瑞 特氏染色液，至略浸过滤纸，视情况补充滴加，维持不干，3－5min 后直接用水冲洗， 吸干或烘干后镜检。 （3）吉姆萨氏染色法：先将吉姆萨染色液原液稀释成常用的吉姆萨染色液（取 5－10 滴原液于 5ml 新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀），在经甲醇固定好的涂片上滴加足量 的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色 30min 或浸染数小时至 24 小时 后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。 2、复染色法：应用两种或两种以上的染料或再加媒染剂进行染色的方法。 （1）革兰氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染 色 1－2min 后，水洗， 再加革兰氏碘液，作用 1－2min 后， 水洗，加 95％酒精脱色 0.5－1min 后，水洗， 稀释石炭酸复红（或沙黄、番红）染色液复染 0.5min 后， 水 洗，干燥，镜检。 （2）抗酸染色法：常用的有萋－尼氏染色法和沙黄－美蓝染色法。 ①萋－尼氏染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的石炭酸复红染色液，酒精 灯火焰上方微微加热至冒出蒸气并维持 3－5min，水洗；再用 3%盐酸酒精脱色至无染色 液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约 1min，水洗，吸干，镜检。 ② 沙黄－美蓝染色法：在已干燥、固定好的涂片上滴加较多量的沙黄染色液，酒精灯 火焰上方微微加热使冒蒸气 3－5 次，维持 1－2min，水洗；再用再用 3%盐酸酒精脱色 至无染色液流出，充分水洗；然后用碱性美蓝染液复染约 1min，水洗，吸干，镜检。 注意事项： 1、做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。 2、固定必须确实，火焰固定时不宜温度过高，以免破坏菌体结构。 3、每种染液染色的过程中应保持染色液不干，尤其加热染色的染液，在染色过程中应 随时添加，以免蒸发干，影响染色效果。 4、每种染液染色后，应用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。 四、教学组织：实验 2-3 人一组，教师认真讲解操作规程，边讲解边示范，学生操作、 观察、做图，在学生基本清楚的下，教师进行分别指导教学。 五、作业：1、实验报告。2、心得体会。3、将每组涂片结果画于实验册上。 实验实训四 常用培养基的制备 一、目的要求：