简单介绍几种常用的细胞破碎仪器
简单介绍几种常用的细胞破碎仪器
(二)核酸提取 1、阴离子去污剂(SDS)法: SDS( sodium dodecyl sulfate)即十二烷基硫酸 钠,是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变 性剂。利用SDS的非极性基团破坏蛋白分子的次级键, 使蛋白变性,使核蛋白解联。应注意的是:变性后 蛋白仍在溶液中,可在室温条件下加入1/2体积饱和硫 酸铵使蛋白沉淀
（二） 核酸提取 1、阴离子去污剂（SDS）法: SDS（sodium dodecyl sulfate）即十二烷基硫酸 钠，是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变 性剂。利用SDS的非极性基团破坏蛋白分子的次级键， 使蛋白变性，使核蛋白解联。 应注意的是： 变性后 蛋白仍在溶液中，可在室温条件下加入1/2体积饱和硫 酸铵使蛋白沉淀
2、酚抽提法 酚作为蛋白变性剂,同时抑制了 DNase的降解作用。现有许多派生的方 法 (1)酚水法一般向溶液中加入等体积用水或缓冲溶液饱和的重蒸酚(除 去氧化物醌),在室温下或低温下摇动混合。变性蛋白分子表面由于含有很 多极性基团与苯酚相似相溶,从而变性蛋白分子(以及细胞残渣)溶于酚相 ,而核酸和多糖溶于水相。其中间为不溶性变性蛋白质。离心分层后取出水 层,多次重复操作,直至中间层无明显变性蛋白为止。然后合并含DNA的 水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀核酸。此法的特点是使提取 的DNA保持天然状态。 受pH影响很大,若pH为中性 NA+RNA偏酸,利于RNA的抽提;若 四pH略偏碱,利于DNA的抽提 proteins) 。例如,DNA在水饱和酚的 Phenol 酸性条件下容易留在有机相 Cell extract Separate layers 。因此,DNA和RNA的酚抽 by centrifugation 提法的pH值是不同的。 酚抽提法示意图
2、酚抽提法: 酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。现有许多派生的方 法。 （1）酚水法 一般向溶液中加入等体积用水或缓冲溶液饱和的重蒸酚（除 去氧化物醌），在室温下或低温下摇动混合。变性蛋白分子表面由于含有很 多极性基团与苯酚相似相溶，从而变性蛋白分子（以及细胞残渣）溶于酚相 ，而核酸和多糖溶于水相。其中间为不溶性变性蛋白质。离心分层后取出水 层，多次重复操作，直至中间层无明显变性蛋白为止。然后合并含DNA 的 水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸 。此法的特点是使提取 的DNA保持天然状态 。 酚抽提法示意图 受pH影响很大，若pH为中性 偏酸，利于RNA的抽提；若 pH略偏碱，利于DNA的抽提 。例如，DNA在水饱和酚的 酸性条件下容易留在有机相 。因此，DNA和RNA的酚抽 提法的pH值是不同的
(2)酚/氯仿法:由于酚水法中的缺点是:能溶解 10-15%的水,从而溶解一部分核酸。因此,加入 氯仿。氯仿的作用是:克服酚的缺点,加速有机相 与水相分层。另外,最后用氯仿抽提还可去除核酸 溶液中的迹量酚(酚易溶于氯仿中)。该法中也常 加入异戊醇:减少蛋白质变性操作过程中产生的气 泡 (3)热酚法此法系向抽提液中加入热酚,于65 度水浴振荡抽提,离心去酚后,再反复抽提3-4次 (加热时间不要超过10min)。目前该法已成为由 动物和细菌细胞制备RNA的标准方法。 (4)SDS-酚法酚与SDS结合,是适用范围最广 的方法之
（2）酚/氯仿法：由于酚水法中的缺点是：能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分核酸。因此，加入 氯仿。氯仿的作用是：克服酚的缺点，加速有机相 与水相分层。另外，最后用氯仿抽提还可去除核酸 溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。该法中也常 加入异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气 泡。 （3） 热酚法 此法系向抽提液中加入热酚，于65 度水浴振荡抽提，离心去酚后，再反复抽提3-4次 （加热时间不要超过10min）。目前该法已成为由 动物和细菌细胞制备RNA的标准方法。 （4） SDS-酚法 酚与SDS结合，是适用范围最广 的方法之一
Phase lock gelˉM-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴侣 对于核酸纯化,常使用酚/氯仿抽提。然 而,实验中常需要面对不同相层的不稳定 预装有 PhaselockGel 为避免将蛋白杂质或有机相连同上清水 的离心管 相一起吸出,我们往往会弃去一部分上清 ,这样会造成相当一部分样品损失,特 别是小体积的酚抽。反之,如果不小心混 入了有机相,又会对下游实验产生抑制作 含有核酸的水相 用 联 有机相层 国内天根( Tiangen)公司有个产品: Phase Lock Gel Phase Lock Gel TM(PLG)。只需将酚氯 仿和样品的混合物加入预装有PLG的管子 里,离心,PLG化合物就会在水相和有机 相之间形成一层致密的固体,将中间层 PhaseLockGe佐在 的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之 水相及有机相之间 形成致密的固相 下,这样,全部水相样品可轻松吸出,完 全不用担心混入杂质,也不用担心酚氯仿 会不小心流出来
Phase Lock Gel™ - 酚/氯仿抽提核酸的最佳伴侣 对于核酸纯化，常使用酚/氯仿抽 提。然 而，实验中常需要面对不同相层的不稳定 。为避免将蛋白杂质或有机相连同上清水 相一起吸出，我们往往会弃去一部分上清 ， 这样会造成相当一部分样品损失，特 别是小体积的酚抽。反之，如果不小心混 入了有机相，又会对下游实验产生抑制作 用。 国内天根（Tiangen）公司有个产品： Phase Lock Gel™ (PLG)。 只需将酚氯 仿和样品的混合物加入预装有PLG的管子 里，离心，PLG化合物就会在水相和有机 相之间形 成一层致密的固体，将中间层 的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之 下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完 全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿 会不小心流 出来