实验四肉中沙门氏菌的检测目的要求1、掌握沙门氏菌的形态、染色特性、培养特性、生化反应及检验程序2、掌握沙门氏菌的血清学鉴定方法器材和试剂1.标本变质肉2.培养基及试剂缓冲蛋白陈水、氯化镁孔雀绿增菌液、亚硫酸盐胱氨酸增菌液、伊红美兰琼脂平板、SS琼脂平板、动力吲哚尿素培养基、柠檬酸盐培养基、尿素培养基、克氏双糖铁培养基、葡萄糖蛋白陈水培养基、甲基红试剂、VP试剂、硝酸盐培养基及A、B试剂、沙门菌O及H因子单价血清、3%过氧化氢溶液。3.其他高压灭菌器、恒温培养箱、接种环、接种针、载玻片、革兰染液、生理盐水。步骤和方法1、标本采集及运送：（1）采样是食品检验中的一个重要环节，所采样品应具有代表性。（2）采样必须用灭菌器具，严格执行无菌操作。（3）样品可分为大、中和小样三类。大样指一整批食品：中样指从样品各部分随机抽的混合样品，以200g为准：小样指做分析用的检样，以25g为准。食品微生物检验一般取小样。（4）根据食品的种类采取不同的采样方法。如固体粉末和液体混合后取样：袋、罐、瓶装食品应取未开封的完整体：冷冻食品在冷冻状态取样，非冷冻食品需在0-5℃保存。（5）样品采集后应立即送检，一般不应超过3h。2、检验方法：食品中沙门菌的检验方法有四个基本步骤：即前增菌或选择性增菌：选择性平板分离沙门菌；生化试验鉴定到属：血清学分型鉴定。（1）增菌培养：将标本25g加入装有225ml缓冲蛋白陈水的500ml广口瓶中。固体食品用均质器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎：粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃土1℃培养4h，移取10ml，转接种在100ml氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，36土1℃培养18-24h.鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必进行前增菌。直接取样25g（25ml）加入灭菌生理盐水25ml，按前述方法制成匀液，取25ml接种于100m亚硫酸盐胱氨酸增菌液内，36℃土1℃培
实验四 肉中沙门氏菌的检测 目的要求 1、 掌握沙门氏菌的形态、染色特性、培养特性、生化反应及检验程序 2、 掌握沙门氏菌的血清学鉴定方法 器材和试剂 1．标本 变质肉 2．培养基及试剂 缓冲蛋白胨水、氯化镁孔雀绿増菌液、亚硫酸盐胱氨酸増菌液、伊红美兰 琼脂平板、SS 琼脂平板、动力吲哚尿素培养基、柠檬酸盐培养基、尿素培养基、克氏双糖铁培养 基、葡萄糖蛋白胨水培养基、甲基红试剂、VP 试剂、硝酸盐培养基及 A、B 试剂、沙门菌 O 及 H 因子单价血清、3%过氧化氢溶液。 3．其他 高压灭菌器、恒温培养箱、接种环、接种针、载玻片、革兰染液、生理盐水。 步骤和方法 1、 标本采集及运送： （1）采样是食品检验中的一个重要环节，所采样品应具有代表性。 （2）采样必须用灭菌器具，严格执行无菌操作。 （3）样品可分为大、中和小样三类。大样指一整批食品；中样指从样品各部分随机抽的混合 样品，以 200g 为准；小样指做分析用的检样，以 25g 为准。食品微生物检验一般取小样。 （4）根据食品的种类采取不同的 采样方法。如固体粉末和液体混合后取样；袋、罐、瓶装食 品应取未开封的完整体；冷冻食品在冷冻状态取样，非冷冻食品需在 0-5℃保存。 （5）样品采集后应立即送检，一般不应超过 3h。 2、检验方法：食品中沙门菌的检验方法有四个基本步骤：即前增菌或选择性增菌；选择性平 板分离沙门菌；生化试验鉴定到属；血清学分型鉴定。 （1）增菌培养：将标本 25g 加入装有 225ml 缓冲蛋白胨水的 500ml 广口瓶中。固体食品用均 质器以 8000-10000r/min 打碎 1min，或用乳钵加灭菌砂磨碎；粉状食品用金属匙或玻璃棒研磨使 其乳化，于 36℃±1℃培养 4h，移取 10ml，转接种在 100ml 氯化镁孔雀绿増菌液或四硫酸钠煌绿 増菌液内，36±1℃培养 18-24h. 鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必进行前增菌。直接取样 25g（25ml）加入灭菌生 理盐水 25ml，按前述方法制成匀液，取 25ml 接种于 100m 亚硫酸盐胱氨酸増菌液内，36℃±1℃培
养18-24h.（2）分离：取增菌液分别接种到伊红美兰琼脂平板、SS琼脂平板，36℃土1℃培养18-24h（3）菌落观察：由于本菌不分解乳糖并产碱，所以在SS琼脂和麦康凯平板上形成无色或淡黄色、半透明、圆形、凸起、边缘整齐的光滑湿润小菌落。产HS的菌株可在SS平板上形成中心带黑褐色的小菌落。（4）生化反应1）氧化酶试验：取氧化酶纸片，刮取SS琼脂上的较大的菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫色为阳性，不变为阴性为阴性（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色）。沙门氏菌氧化酶试验为阴性。2）初步试验鉴定：将沙门氏菌分别接种在克氏双糖铁琼脂、动力哚尿素培养基、葡萄糖蛋白陈水管和硝酸盐培养基管中，经35℃孵育18-24h后，加入相应试剂，观察结果。同时做触酶试验。结果见表1表1沙门氏菌的基本生化反应KIAMIU硝酸盐氧化酶触酶还原斜面底层产产气HeS动力吲哚脲酶KA+/-++:+伤寒沙门菌--酒KA+-/++++甲型副伤寒KA++++-+乙型副伤寒-一氧化酶试验原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醒类化合物。甲基红试验的原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使pH降至4.5以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则H6，2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性。V-P试验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为V-P试验阳性动力靛基质尿素酶培养基原理：制备的动力靛基质尿素酶培养基除加有200g/L尿素和酚红指示剂外，其蛋白陈较原克利斯顿森尿素培养基提高10倍，并制成半固体培养基，以便观察细菌的动力。由于蛋白陈中含有丰富的色氨酸，产生色氨酸酶的细菌可以水解色氨酸形成靛基质，当加入靛基质试剂后形成玫瑰吲哚。产生玫瑰红色为阳性。产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产碱，使酚红指示剂显桃红色。因此，该试验可同时观察细菌动力、靛基质的产生和细菌分解尿素的活性，故简称为MIU试验过氧化氢酶试验原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐
养 18-24h. （2）分离：取増菌液分别接种到伊红美兰琼脂平板、SS 琼脂平板，36℃±1℃培养 18-24h. （3）菌落观察：由于本菌不分解乳糖并产碱，所以在 SS 琼脂和麦康凯平板上形成无色或淡黄 色、半透明、圆形、凸起、边缘整齐的光滑湿润小菌落。产 H2S 的菌株可在 SS 平板上形成中心带 黑褐色的小菌落。 （4）生化反应 1）氧化酶试验：取氧化酶纸片，刮取 SS 琼脂上的较大的菌落，观察纸片颜色的变化，呈蓝紫 色为阳性，不变为阴性为阴性（如试剂为盐酸二甲基对苯二胺，阳性者则为红色）。沙门氏菌氧化 酶试验为阴性。 2）初步试验鉴定：将沙门氏菌分别接种在克氏双糖铁琼脂、动力吲哚尿素培养基、葡萄糖蛋 白胨水管和硝酸盐培养基管中，经 35℃孵育 18-24h 后，加入相应试剂，观察结果。同时做触酶试 验。结果见表 1 表 1 沙门氏菌的基本生化反应 KIA MIU 硝酸盐 氧化酶 触酶 还原 斜面 底层 产气 H2S 动力 吲哚 脲酶 伤寒沙门菌 K A - +/- + - - - + + 甲型副伤寒 K A + -/+ + - - - + + 乙型副伤寒 K A + + + - - - + + 氧化酶试验原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细 胞色素 C 氧化，再由氧化型细胞色素 C 使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。 甲基红试验的原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，进一步分解，产生甲酸等，使 pH 降至 4．5 以下，加入甲基红试剂则呈红色为阳性。若分解葡萄糖产酸量少，则 pH 6．2 以上，故加入甲基红 指示剂呈黄色，为阴性。 V-P 试验原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，脱羧产生乙酰甲基甲醇，在碱性环境中被氧 氧化为二乙酰，进而与胍基起作用生成红色化合物，则为 V-P 试验阳性 动力靛基质尿素酶培养基原理：制备的动力靛基质尿素酶培养基除加有 200g/L 尿素和酚红指 示剂外，其蛋白胨较原克利斯顿森尿素培养基提高 10 倍，并制成半固体培养基，以便观察细菌的 动力。由于蛋白胨中含有丰富的色氨酸，产生色氨酸酶的细菌可以水解色氨酸形成靛基质，当加入 靛基质试剂后形成玫瑰吲哚。产生玫瑰红色为阳性。产生尿素酶的细菌将培养基中的尿素分解产碱， 使酚红指示剂显桃红色。因此，该试验可同时观察细菌动力、靛基质的产生和细菌分解尿素的活性， 故简称为 MIU 试验 过氧化氢酶试验原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成 分子氧出现气泡。 硝酸盐还原试验原理：硝酸盐还原反应包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚硝 酸盐和氨，再由氨转化为氨基酸和细胞内其他含氮化合物；二是在代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐 代替氧作为呼吸酶系统中的终末受氢体。能使硝酸盐还原的细菌从硝酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐