蛋白质实验技术模块教案 一、教学内容： 1、 蛋白质分离纯化与分析 ： 每 2 人一组，共 18—19 组×2,每组 5d,5×9=45 学时 ×2。 2、 DNA 的制备与分析 ： 每 2 人一组,共 18~19 组×2 班,每组 2d,2×9×2=36 学 时。 二、具体内容： cytc 分离一天。 生物大分子制备的原理 2 学时。 PAGE,PI—PAGE,SDS—PAGE 原理 2 学时。 Sephadex G100 等层析原理 2 学时。 分离物的 Sephadex G100 纯化,1.5d。 分离,纯化过程中所获阶段样品的 SDS—PAGE 跟踪及分度分析,1.5d。 纯化物的进一步分析的设想,2 学时。 DNA 分离纯化原理及注意事项,2 学时。 兔肝 DNA 的分离纯化,1d。 DNA 的理化性质分析， 7 学时。 三、教学目的: 1、 模拟生化大分子制备的全过程开展较为系统性的训练。 2、 掌握现代仪器在生化样品制备与分析中的应用及其原理。 3、 掌握两类生物大分子分离纯化,理化性质分析的基本原理及注意事项。 四、cytc 的分离： （一） 实验方法步骤见教学讲义 P21。 （二） 各步骤的基本目的与要求： 取材——猪心，要求新鲜，cytc 未被破坏，含 cytc 高，材料易得。 加等量 0.145mol/l TCA，使 cytc 从线粒体膜上解聚下来，使呈酸性可 溶状态。 过滤——去杂质。 调 PH 至 7.3——以利于（NH4）2SO4 沉淀去杂蛋白，缓慢添加。 第二次加（NH4）2SO4 的作用是进一步去除杂蛋白，缓慢添加。 两次添加（NH4）2SO4 后，cytc 仍呈可溶性。 静置过中午或至少 2h，目的是解水合，使蛋白质凝聚成絮状，以利于 通过离心方法去沉淀。 加入 20%TCA（25mol/l 上清）——沉淀 cytc。 透析——去掉酸，去小分子，为上 Sephadex G100 作准备。 透析要求：低温，不漏，换透析液，用 Ba+方法检查透析的效果。 五、离心机： 1． 类型：实验室用与工业用，间歇式与连续式，冷冻式与不冷冻式，地 面式与桌式，普通离心机和高速离心机与超速离心机，制备式与分析 式。 2． 实验室常用离心机： 普通离心机——台式（3000-16000rpm）和地面式（3000-6000rpm）
蛋白质实验技术模块教案 一、教学内容： 1、 蛋白质分离纯化与分析 ： 每 2 人一组，共 18—19 组×2,每组 5d,5×9=45 学时 ×2。 2、 DNA 的制备与分析 ： 每 2 人一组,共 18~19 组×2 班,每组 2d,2×9×2=36 学 时。 二、具体内容： cytc 分离一天。 生物大分子制备的原理 2 学时。 PAGE,PI—PAGE,SDS—PAGE 原理 2 学时。 Sephadex G100 等层析原理 2 学时。 分离物的 Sephadex G100 纯化,1.5d。 分离,纯化过程中所获阶段样品的 SDS—PAGE 跟踪及分度分析,1.5d。 纯化物的进一步分析的设想,2 学时。 DNA 分离纯化原理及注意事项,2 学时。 兔肝 DNA 的分离纯化,1d。 DNA 的理化性质分析， 7 学时。 三、教学目的: 1、 模拟生化大分子制备的全过程开展较为系统性的训练。 2、 掌握现代仪器在生化样品制备与分析中的应用及其原理。 3、 掌握两类生物大分子分离纯化,理化性质分析的基本原理及注意事项。 四、cytc 的分离： （一） 实验方法步骤见教学讲义 P21。 （二） 各步骤的基本目的与要求： 取材——猪心，要求新鲜，cytc 未被破坏，含 cytc 高，材料易得。 加等量 0.145mol/l TCA，使 cytc 从线粒体膜上解聚下来，使呈酸性可 溶状态。 过滤——去杂质。 调 PH 至 7.3——以利于（NH4）2SO4 沉淀去杂蛋白，缓慢添加。 第二次加（NH4）2SO4 的作用是进一步去除杂蛋白，缓慢添加。 两次添加（NH4）2SO4 后，cytc 仍呈可溶性。 静置过中午或至少 2h，目的是解水合，使蛋白质凝聚成絮状，以利于 通过离心方法去沉淀。 加入 20%TCA（25mol/l 上清）——沉淀 cytc。 透析——去掉酸，去小分子，为上 Sephadex G100 作准备。 透析要求：低温，不漏，换透析液，用 Ba+方法检查透析的效果。 五、离心机： 1． 类型：实验室用与工业用，间歇式与连续式，冷冻式与不冷冻式，地 面式与桌式，普通离心机和高速离心机与超速离心机，制备式与分析 式。 2． 实验室常用离心机： 普通离心机——台式（3000-16000rpm）和地面式（3000-6000rpm）
一般不带冷冻设备，由电机和转子所组成，转速由电压调节器 调节。 高速冷冻离心机——台式与地面式，18000-25000rpm，0-4℃。 上述+制冷设备及温度检测器。 超速离心机——地面式，达 30000rpm，0-4℃。 上述+真空设备及真空检测器。 3． 转子：角式与水平式转子，角式常用于沉降离心，水平式还常用于梯 度离心。 4． 离心原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加速颗粒的沉 淀速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度的物质分离开。 F=ω2ω2 r。 ω是角速度（弧度/秒）。r 是颗粒的旋转半径（厘 米） F 是任何颗粒所经受的向外离心力。 RCF=ω2 r/980, RCF 是相对离心力，单位为 G；980 是地心引力， 单位为厘米/秒²。 RCF=⒈119×10－5n 2 r, n 为每分钟的转数。 处于离心管内不同位置的颗粒所受的离心力不同，常以离心管中点 至旋转中心距离为 r 时所得到相对离心图表示为平均离心力。 离心力的计算使不同转速和不同离心半径的离心，统一到相同的 离心中去衡量颗粒在离心中所受外加作用力的大小，以利用因不同离 心机，不同转子在使用中所选择的离心时间和转速。 离心时间：t= [(㏑ r2-㏑ r1)/ ω2 ]/s t 为样品颗粒完全沉降到离心管底的时间(秒). S 为沉降系数. r2 为旋转轴中心到离心管底部的距离(厘米). r1 为旋转轴中心到样品液液面的距离(厘米). 5.离心方法: (1) 差速离心法: 定义，应用于沉降系数相差一~几个数量级颗粒的分离。 缺点：a.分离效果差,不能一次得到纯颗粒,经再悬浮和再离心(2~3 次), 才能得到较纯的颗粒。 b.壁效应严重,在离心管一侧会出现沉淀。 c.颗粒被挤压,可能变形,聚集而失活。 （2）梯度离心： 定义,应用于相差较少(20%或更少)或分子量相差三倍的蛋 白质。 优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒, 又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 c.颗粒不会挤压变形。 缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不易掌握。 常用的密度梯度离心方法有：蔗糖密度梯度离心；氯化铯等密度梯度离心。 6.普通离心机使用注意事项:
一般不带冷冻设备，由电机和转子所组成，转速由电压调节器 调节。 高速冷冻离心机——台式与地面式，18000-25000rpm，0-4℃。 上述+制冷设备及温度检测器。 超速离心机——地面式，达 30000rpm，0-4℃。 上述+真空设备及真空检测器。 3． 转子：角式与水平式转子，角式常用于沉降离心，水平式还常用于梯 度离心。 4． 离心原理：利用转子高速旋转时所产生的强大离心力，加速颗粒的沉 淀速度，把样品中不同沉降系数或浮力密度的物质分离开。 F=ω2ω2 r。 ω是角速度（弧度/秒）。r 是颗粒的旋转半径（厘 米） F 是任何颗粒所经受的向外离心力。 RCF=ω2 r/980, RCF 是相对离心力，单位为 G；980 是地心引力， 单位为厘米/秒²。 RCF=⒈119×10－5n 2 r, n 为每分钟的转数。 处于离心管内不同位置的颗粒所受的离心力不同，常以离心管中点 至旋转中心距离为 r 时所得到相对离心图表示为平均离心力。 离心力的计算使不同转速和不同离心半径的离心，统一到相同的 离心中去衡量颗粒在离心中所受外加作用力的大小，以利用因不同离 心机，不同转子在使用中所选择的离心时间和转速。 离心时间：t= [(㏑ r2-㏑ r1)/ ω2 ]/s t 为样品颗粒完全沉降到离心管底的时间(秒). S 为沉降系数. r2 为旋转轴中心到离心管底部的距离(厘米). r1 为旋转轴中心到样品液液面的距离(厘米). 5.离心方法: (1) 差速离心法: 定义，应用于沉降系数相差一~几个数量级颗粒的分离。 缺点：a.分离效果差,不能一次得到纯颗粒,经再悬浮和再离心(2~3 次), 才能得到较纯的颗粒。 b.壁效应严重,在离心管一侧会出现沉淀。 c.颗粒被挤压,可能变形,聚集而失活。 （2）梯度离心： 定义,应用于相差较少(20%或更少)或分子量相差三倍的蛋 白质。 优点：a.分离效果好，可一次获得较纯颗粒。 b.适应范围广,能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒, 又能分离有一定浮力密度差的颗粒。 c.颗粒不会挤压变形。 缺点：离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不易掌握。 常用的密度梯度离心方法有：蔗糖密度梯度离心；氯化铯等密度梯度离心。 6.普通离心机使用注意事项:
(1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2).使用前应检查套环是否平衡(台称)。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡(台称)。 (4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子 的对称位置。 (5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。 (6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要 2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间(10min)。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。 六、生物大分子制备的实验设计 （一）生物大分子制备的意义。 随着分子生物学研究的进展，人们不但要研究生物体内一种物质的结构与功能， 而且要研究所有物质的结构与功能。 只有掌握所有物质的结构与功能，才能阐明它们是如何生物合成又是如何加工的， 以最终阐明这些物质在什么阶段合成，它们的结构如何，它们在生命的生长发育和衰 老中的作用。 人类基因组计划的顺利完成以及后基因组计划的实施就是按照这样的思路而进行 的。 人类基因组计划——植物——水稻基因组计划——酵母细菌病毒的基因计划—— 蛋白质组学——目的是揭示生命活动的规律。可见，阐明生命不同物质结构与功能的 研究已成为可能。人类遗传性，非遗传性疾病的防治，肿瘤的成因及其防治已不是理 想，而将变为现实。 在人们的科学研究，生产活动中，往往会遇到一些现象，如比较同种物种的不同 个体，发现有一差异的 mRNA，差异的蛋白质等，环境因素影响也会出现这种现象， 那么人们对于掌握这一差异物质的功能就显得尤其迫切。所以生物大分子研究也成为 势在必行的重要内容。 而这些研究，总是以纯化这些大分子物质为前提的，所以同学们必须学习这部分 内容。 （二）生物大分子制备方法的特点 1． 生物材料组成非常复杂，常包括数百种甚至数千种化合物，各种化合物的形状， 大小，分子量和理化性质各不同，其中有不少化合物迄今还是未知物质，而且这 些化合物在分离时仍不断在新陈代谢中。 2． 有些化合物在材料中含量极微，只有万分之一，或是几十万分之一，甚至几百万 分之一。如脑垂体组织提取某些激素的释放因子，蚕的信息素，竹笋的竹笋素等 都是从几吨到十几吨才能得到几毫克的目的物。 3． 许多生物大分一旦离开生物体内环境，很快变性，破坏。因此在分离过程中必须 保护这些化合物的生理活性，这也是最难做到的一点。在分离中，过酸，过碱， 重金属离子，高温，剧烈的机械作用，强烈的辐射和体内自身酶的作用，均可破 坏这些分子的生理活性。故分离具生物活性物质，常用十分温和的条件，并尽可 能在较低温度和洁净环境下进行。 4． 生化分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH 值，离子强度等）对溶 液中各种组成综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强，实验结果 往往有很大的经验成分。因此一个实验的重复性的建立，从材料至方法直至各种
(1).离心机要置水平位置,以保证旋转轴垂直地球水平面。 (2).使用前应检查套环是否平衡(台称)。 (3).离心杯及其外套(离心管套)是否平衡(台称)。 (4).样品倾入离心杯后应与离心管套一起两两平衡，平衡后把它们放置于转子 的对称位置。 (5).盖好盖子,打开电源开关,调整离心时间。 (6).启动离心时转速应由小至大,缓慢升速(一般要 2~3min)。 (7).达到预定转速后再调整离心时间至预定时间(10min)。 (8).离心完成后要调整调速连杆至零位,同时关上电源。 (9).要等到转速为零时才能打开离心机盖,取出样品。 六、生物大分子制备的实验设计 （一）生物大分子制备的意义。 随着分子生物学研究的进展，人们不但要研究生物体内一种物质的结构与功能， 而且要研究所有物质的结构与功能。 只有掌握所有物质的结构与功能，才能阐明它们是如何生物合成又是如何加工的， 以最终阐明这些物质在什么阶段合成，它们的结构如何，它们在生命的生长发育和衰 老中的作用。 人类基因组计划的顺利完成以及后基因组计划的实施就是按照这样的思路而进行 的。 人类基因组计划——植物——水稻基因组计划——酵母细菌病毒的基因计划—— 蛋白质组学——目的是揭示生命活动的规律。可见，阐明生命不同物质结构与功能的 研究已成为可能。人类遗传性，非遗传性疾病的防治，肿瘤的成因及其防治已不是理 想，而将变为现实。 在人们的科学研究，生产活动中，往往会遇到一些现象，如比较同种物种的不同 个体，发现有一差异的 mRNA，差异的蛋白质等，环境因素影响也会出现这种现象， 那么人们对于掌握这一差异物质的功能就显得尤其迫切。所以生物大分子研究也成为 势在必行的重要内容。 而这些研究，总是以纯化这些大分子物质为前提的，所以同学们必须学习这部分 内容。 （二）生物大分子制备方法的特点 1． 生物材料组成非常复杂，常包括数百种甚至数千种化合物，各种化合物的形状， 大小，分子量和理化性质各不同，其中有不少化合物迄今还是未知物质，而且这 些化合物在分离时仍不断在新陈代谢中。 2． 有些化合物在材料中含量极微，只有万分之一，或是几十万分之一，甚至几百万 分之一。如脑垂体组织提取某些激素的释放因子，蚕的信息素，竹笋的竹笋素等 都是从几吨到十几吨才能得到几毫克的目的物。 3． 许多生物大分一旦离开生物体内环境，很快变性，破坏。因此在分离过程中必须 保护这些化合物的生理活性，这也是最难做到的一点。在分离中，过酸，过碱， 重金属离子，高温，剧烈的机械作用，强烈的辐射和体内自身酶的作用，均可破 坏这些分子的生理活性。故分离具生物活性物质，常用十分温和的条件，并尽可 能在较低温度和洁净环境下进行。 4． 生化分离方法几乎都在溶液中进行，各种参数（温度，pH 值，离子强度等）对溶 液中各种组成综合影响常常无法固定，以致许多实验设计理论性不强，实验结果 往往有很大的经验成分。因此一个实验的重复性的建立，从材料至方法直至各种
环境条件，使用的试剂药品等都必须严格的加以规定。 5． 为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多 阶式”进行（常说逐层剥皮式）。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种 分离方法，才能达到纯化目的。 （钓鱼法——亲和层析法） 6． 生化分离方法的最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，其均一性 的评定常常是有条件的或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对的“均一 性”结论。 （三）生化分离制备的基本原理 与一般化学分离方法原理有许多相同，相通之处。 用于生物化学分离制备的技术，大都根据混合物中的不同组分分配率的差异把它们 分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（有机溶剂抽提，盐析，结晶等）。或者 将混合物置于某一物相（大多数为液相）中，外加一定作用力，使各组分分配于不同 区域，从而达到分离目的（如电泳，超离心，超过滤）。 几乎所有有机大分子物质都不能融化和蒸发（除氨基酸脂肪酸，某些维生素外）。 只限于分配在固相和液相中，并在这两相之间相互交替进行分离纯化。 ———————————————— F1 A<——————A——————F2 A F1 B<——————B——————F2 B 运动方向 a 色谱：吸附色谱，离子交换，分配，分子筛等。 F1 为流体动力；F2 为表面能，范德瓦尔 斯力位阻效应，静电引力，极化度分子筛效应，渗透（扩散），偶极作用，缔合和解 离效应等。 b 电场力： F1 为静电引力；F2 为分子摩擦力，极化度动电作用 c.扩散方法： F1 为电动力，渗透力，流体动力；F2 为分子筛效应电动力。 d.结晶： F1 为结晶格子能；F2 扩散。 e.沉降： F1 为重力，离心力；F2 为分子摩擦效应。 上述分离依据：极性，离子性质及分子大小，分子大小及形状， 介质密度。 两物质彼此分开： F1 A﹣F2 A =ΔF A F1 B﹣F2 B =ΔF B ΔF A /ΔF B=ΔF ∴在分离混合物的各组分中，必须尽量设法扩大各组分之间的ΔF 的差别。 （四）生化分离制备实验的设计，大致可分为五个阶段： 1．确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法 目的：a.在原有实验方法的基础上加以改进，求更多更纯产品。 b.为了获得新物质： 无意识的：实验中发现异常情况的追究。 有目的的：去追踪引起某现象发生的物质基础。 鉴定方法： a.生物测定方法。 b.理化测定方法，如呈色法，色谱法，光谱法，电泳法， 核磁共振法等
环境条件，使用的试剂药品等都必须严格的加以规定。 5． 为保护所提取物质的生理活性及结构上的完整性，生化分离方法多采取温和的“多 阶式”进行（常说逐层剥皮式）。常常少至几个多至几十个步骤，并不断变换各种 分离方法，才能达到纯化目的。 （钓鱼法——亲和层析法） 6． 生化分离方法的最后均一性的证明与化学上纯度的概念并不完全相同，其均一性 的评定常常是有条件的或者只能通过不同角度测定，最后才能给出相对的“均一 性”结论。 （三）生化分离制备的基本原理 与一般化学分离方法原理有许多相同，相通之处。 用于生物化学分离制备的技术，大都根据混合物中的不同组分分配率的差异把它们 分配于可用机械方法分离的两个或几个物相中（有机溶剂抽提，盐析，结晶等）。或者 将混合物置于某一物相（大多数为液相）中，外加一定作用力，使各组分分配于不同 区域，从而达到分离目的（如电泳，超离心，超过滤）。 几乎所有有机大分子物质都不能融化和蒸发（除氨基酸脂肪酸，某些维生素外）。 只限于分配在固相和液相中，并在这两相之间相互交替进行分离纯化。 ———————————————— F1 A<——————A——————F2 A F1 B<——————B——————F2 B 运动方向 a 色谱：吸附色谱，离子交换，分配，分子筛等。 F1 为流体动力；F2 为表面能，范德瓦尔 斯力位阻效应，静电引力，极化度分子筛效应，渗透（扩散），偶极作用，缔合和解 离效应等。 b 电场力： F1 为静电引力；F2 为分子摩擦力，极化度动电作用 c.扩散方法： F1 为电动力，渗透力，流体动力；F2 为分子筛效应电动力。 d.结晶： F1 为结晶格子能；F2 扩散。 e.沉降： F1 为重力，离心力；F2 为分子摩擦效应。 上述分离依据：极性，离子性质及分子大小，分子大小及形状， 介质密度。 两物质彼此分开： F1 A﹣F2 A =ΔF A F1 B﹣F2 B =ΔF B ΔF A /ΔF B=ΔF ∴在分离混合物的各组分中，必须尽量设法扩大各组分之间的ΔF 的差别。 （四）生化分离制备实验的设计，大致可分为五个阶段： 1．确定制备物研究目的及建立相应的分析鉴定方法 目的：a.在原有实验方法的基础上加以改进，求更多更纯产品。 b.为了获得新物质： 无意识的：实验中发现异常情况的追究。 有目的的：去追踪引起某现象发生的物质基础。 鉴定方法： a.生物测定方法。 b.理化测定方法，如呈色法，色谱法，光谱法，电泳法， 核磁共振法等
c.理化+生物测定法：如虾的蜕皮激素的分离，用理化法不能用（含量极低），用丽 蝇的生物测定法结合理化法，从 1000Kg 得 2mg 蜕皮激素。又如，蚕的蚕醇 用 气相色谱法+蚕蛾兴奋反应法。 2.制备物物理化学性质稳定性预备试验 A.溶解性 在水或各种稀酸的溶解性。 弱酸性溶剂（乙醇，甲醇，丙酮）的溶解性。 各种非极性溶剂中（氯仿及各种烃类）的溶解性。 B.溶液的稳定性 pH 稳定范围，温度效应，各种缓冲液的影 响，有机溶剂的影响。 C.固态时稳定性 温度，水分的影响，低压冻干效应 D.物理性质 通过不同大小孔径膜的能力，在固体上的吸附作 用，在电场中每一 pH 的迁移率，在超离心力场中 的沉降行为。 E.化学性质 膜蛋白酶及其他蛋白酶，DNase，Rnase，糖类 水解酶等作用 的稳定性，在温和条件下乙酰化作用 的稳定性，对亚硝酸作用的稳定性，酯化作用的稳 定性。 3．材料处理及抽提方法的选择. 处理：机械法，物理化学（反复冻融发，骤热骤冷法，超声波 处理法等）及生物处理法（自溶法，酶解法，表面活性 处理法） 抽提：水，酸碱盐，表面活性剂，有机溶剂。 4．分离纯化方法的摸索。 分离方法： 色谱法 逆流分配 电泳法 沉降法 透析 溶解度（盐析，有机溶剂抽提） 5．获取制备物以后，均一性的测定。 溶解度法 电泳均一性测定法 高速离心沉降法
c.理化+生物测定法：如虾的蜕皮激素的分离，用理化法不能用（含量极低），用丽 蝇的生物测定法结合理化法，从 1000Kg 得 2mg 蜕皮激素。又如，蚕的蚕醇 用 气相色谱法+蚕蛾兴奋反应法。 2.制备物物理化学性质稳定性预备试验 A.溶解性 在水或各种稀酸的溶解性。 弱酸性溶剂（乙醇，甲醇，丙酮）的溶解性。 各种非极性溶剂中（氯仿及各种烃类）的溶解性。 B.溶液的稳定性 pH 稳定范围，温度效应，各种缓冲液的影 响，有机溶剂的影响。 C.固态时稳定性 温度，水分的影响，低压冻干效应 D.物理性质 通过不同大小孔径膜的能力，在固体上的吸附作 用，在电场中每一 pH 的迁移率，在超离心力场中 的沉降行为。 E.化学性质 膜蛋白酶及其他蛋白酶，DNase，Rnase，糖类 水解酶等作用 的稳定性，在温和条件下乙酰化作用 的稳定性，对亚硝酸作用的稳定性，酯化作用的稳 定性。 3．材料处理及抽提方法的选择. 处理：机械法，物理化学（反复冻融发，骤热骤冷法，超声波 处理法等）及生物处理法（自溶法，酶解法，表面活性 处理法） 抽提：水，酸碱盐，表面活性剂，有机溶剂。 4．分离纯化方法的摸索。 分离方法： 色谱法 逆流分配 电泳法 沉降法 透析 溶解度（盐析，有机溶剂抽提） 5．获取制备物以后，均一性的测定。 溶解度法 电泳均一性测定法 高速离心沉降法