(4)利于酶的分离纯化 (5)安全可靠,无毒性 ◆产酶微生物:细菌、放线菌、霉菌、酵母等。 21细菌 细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌等。 (1)大肠杆菌( Escherichia co∥) 大肠杆菌细胞有的呈杆状,有的近似球状大小为05×1.0~30μm,一般无荚膜 无芽孢,革兰氏染色阴性,运动或不运动,运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色,光滑 闪光,扩展。 大肠杆菌可以用于生产多种酶。大肠杆菌产生的酶一般都属于胞内酶,需要经过细胞破 碎才能分离得到。例如,大肠杆菌谷氨酸脱羧酶,用于测定谷氨酸含量或用于生产γ氨基丁 酸;大肠杄菌天门冬氨酸酶,用于催化延胡索酸加氨生产L-天门冬氨酸;大肠杄菌青霉素 酰化酶,用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素;大肠杆菌天门冬酰胺酶,对白血病具有显 著疗效;大肠杆菌β-半乳糖苷酶,用于分解乳糖或其他β-半乳糖苷。采用大肠杆菌生产的 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等,在基因工程等方面广泛 应用 (2)枯草杆菌(Bac∥/ us subtilis) 枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状,大小为0.7~0.8×2~3μm,单个细胞,无 荚膜,周生鞭毛,运动,革兰氏染色阳性。芽孢06~0.9×1.0~1.5μm,椭圆至柱状。 菌落粗糙,不透明,不闪光,扩张,污白色或微带黄色。 枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物,可以用于生产α-淀粉酶,蛋白酶β-葡聚糖
(4)利于酶的分离纯化 (5)安全可靠，无毒性 ◆产酶微生物: 细菌、放线菌、霉菌、酵母等。 2.1 细菌 细菌是在工业上有重要应用价值的原核微生物。在酶的生产中常用的细菌有大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌等。 (1)大肠杆菌（Escherichia coli） 大肠杆菌细胞有的呈杆状，有的近似球状, 大小为 0.5 ×1.0～3.0 μm，一般无荚膜， 无芽孢，革兰氏染色阴性，运动或不运动 ，运动者周生鞭毛。菌落从白色到黄白色，光滑 闪光，扩展。 大肠杆菌可以用于生产多种酶。大肠杆菌产生的酶一般都属于胞内酶，需要经过细胞破 碎才能分离得到。例如，大肠杆菌谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或用于生产γ-氨基丁 酸；大肠杆菌天门冬氨酸酶，用于催化延胡索酸加氨生产 L-天门冬氨酸；大肠杆菌青霉素 酰化酶，用于生产新的半合成青霉素或头孢霉素；大肠杆菌天门冬酰胺酶，对白血病具有显 著疗效；大肠杆菌β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖或其他β-半乳糖苷。采用大肠杆菌生产的 限制性核酸内切酶、DNA 聚合酶、DNA 连接酶、核酸外切酶等， 在基因工程等方面广泛 应用。 (2)枯草杆菌（Bacillus subtilis） 枯草杆菌是芽孢杆菌属细菌。细胞呈杆状，大小为 0.7～0.8 ×2～3 μm, 单个细胞, 无 荚膜，周生鞭毛，运动， 革兰氏染色阳性。芽孢 0.6～0.9 × 1.0～1.5 μm,椭圆至柱状。 菌落粗糙，不透明，不闪光，扩张，污白色或微带黄色。 枯草芽孢杆菌是应用最广泛的产酶微生物，可以用于生产α-淀粉酶, 蛋白酶, β-葡聚糖
酶,5′-核苷酸酶,碱性磷酸酶等。例如,枯草杄菌BF7658是国内用于生产α-淀粉酶的 主要菌株;枯草杄菌AS1.398用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸簙。枯草杄菌生产的α淀粉 酶和蛋白酶等都是胞外酶,而其产生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。 22放线菌 actinomycetes) 放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉 菌( Streptomyces 链霉菌菌落呈放射状,具有分枝的菌丝体,菌丝直径0.2~1,2μm。革兰氏染色阳性。 菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分,基内菌丝不断裂,只有气生菌丝形成孢子链 链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外,链霉菌还含有丰富的16α羟化酶,可用于 甾体转化。 23霉菌 霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、 木霉、根霉、毛霉等 (1)黑曲霉( Asper∥ us niger) 黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成,菌丛黑褐色,顶 囊大球形,小梗双层,分生孢子球形,平滑或粗糙。 黑曲酶可用于生产多种酶,有胞外酶也有胞内酶。例如,糖化酶,α-淀粉酶,酸性蛋 白酶,果胶酶,葡萄糖氧化酶,过氧化氢酶,核糖核酸酶,脂肪酶,纤维素酶,橙皮苷酶, 柚苷酶等 (2)米曲酶( Aspergil∥ s oryzae 米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色,后变为黄褐色,分生孢子头呈放射
酶，5’-核苷酸酶，碱性磷酸酶等。例如，枯草杆菌 BF7658 是国内用于生产α-淀粉酶的 主要菌株；枯草杆菌 AS1.398 用于生产中性蛋白酶和碱性磷酸酶。枯草杆菌生产的α-淀粉 酶和蛋白酶等都是胞外酶，而其产生的碱性磷酸酶存在于细胞间质之中。 2.2 放线菌(actinomycetes) 放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物。常用于酶发酵生产的放线菌主要是链霉 菌(Streptomyces)。 链霉菌菌落呈放射状，具有分枝的菌丝体，菌丝直径 0.2～1.2μm。革兰氏染色阳性。 菌丝有气生菌丝和基内菌丝之分，基内菌丝不断裂，只有气生菌丝形成孢子链。 链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶、 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。此外，链霉菌还含有丰富的 16α羟化酶，可用于 甾体转化。 2.3 霉菌 霉菌是一类丝状真菌。用于酶的发酵生产的霉菌主要有黑曲霉、米曲霉、红曲霉、青霉、 木霉、根霉、毛霉等。 (1) 黑曲霉（Aspergillus niger） 黑曲霉是曲霉属黑曲霉群霉菌。菌丝体由具有横隔的分支菌丝构成， 菌丛黑褐色，顶 囊大球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。 黑曲酶可用于生产多种酶，有胞外酶也有胞内酶。例如， 糖化酶，α-淀粉酶, 酸性蛋 白酶，果胶酶，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶，核糖核酸酶，脂肪酶，纤维素酶，橙皮苷酶， 柚苷酶等。 (2) 米曲酶(Aspergillus oryzae) 米曲霉是曲霉属黄曲霉群霉菌。菌丛一般为黄绿色，后变为黄褐色，分生孢子头呈放射
形,顶囊球形或瓶形,小梗一般为单层,分生孢子球形,平滑,少数有刺,分生孢子梗长达 2mm左右,粗糙 米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强,这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造 中广泛应用。此外,米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶P (3)红曲霉( Monascus) 红曲霉菌落初期白色,老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝 具有隔膜,多核,分枝甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端,单生或成链,闭囊壳球 形,有柄,其内散生十多个子囊,子囊球形,内含8个子囊孢子,成熟后子囊壁解体,孢 子则留在闭囊壳内。 红曲霉可用于生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 (4)青霉( Penicil∥im) 青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色,有横隔,分生孢子梗亦 有横隔,光滑或粗糙,顶端形成帚状分枝,小梗顶端串生分生孢子,分生孢孑球形、椭圆形 或短柱形,光滑或粗糙,大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳,其内形成子囊 和子囊孢子,亦有少数菌种产生菌核。 青霉菌种类很多,其中产黄青霉( Penicilllum chσ ysogenun)用于生产葡萄糖氧化 酶、苯氧甲基青霉素酰化酶(主要作用于青霉素)果胶酶、纤维素酶等。桔青霉( Penicillium citrinum)用于生产5′-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶S 核酸酶P1等 5).木霉( Trichoderma) 木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速,呈棉絮状或致密丛束状,菌落表面呈不同程
形，顶囊球形或瓶形，小梗一般为单层，分生孢子球形，平滑，少数有刺，分生孢子梗长达 2 mm 左右，粗糙。 米曲霉中糖化酶和蛋白酶的活力较强，这使米曲霉在我国传统的酒曲和酱油曲的制造 中广泛应用。此外，米曲霉还可以用于生产氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶、核酸酶 P 等。 (3) 红曲霉（Monascus） 红曲霉菌落初期白色，老熟后变为淡粉色、紫红色或灰黑色。通常形成红色色素。菌丝 具有隔膜，多核，分枝甚繁。分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，单生或成链，闭囊壳球 形，有柄，其内散生十多个子囊，子囊球形，内含 8 个子囊孢子，成熟后子囊壁解体，孢 子则留在闭囊壳内。 红曲霉可用于生产α-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。 (4) 青霉(Penicillium) 青霉属半知菌纲。其营养菌丝体无色、淡色或具有鲜明的颜色，有横隔，分生孢子梗亦 有横隔，光滑或粗糙，顶端形成帚状分枝，小梗顶端串生分生孢子，分生孢子球形、椭圆形 或短柱形，光滑或粗糙，大部分在生长时呈蓝绿色。有少数种会产生闭囊壳，其内形成子囊 和子囊孢子，亦有少数菌种产生菌核。 青霉菌种类很多，其中产黄青霉（Penicillium chrysogenum ）用于生产葡萄糖氧化 酶、苯氧甲基青霉素酰化酶（主要作用于青霉素）果胶酶、纤维素酶等。桔青霉（Penicillium cityrinum）用于生产 5’-磷酸二酯酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶、核酸酶 S1、 核酸酶 P1等。 (5)．木霉(Trichoderma) 木霉属于半知菌纲。生长时菌落生长迅速，呈棉絮状或致密丛束状，菌落表面呈不同程
度的绿色,菌丝透明,有分隔,分枝繁复,分枝上可继续分枝,形成二级分枝、三级分枝, 分支末端为小梗,瓶状,束生、对生、互生或单生,分生孢子由小梗相继生出,靠粘液把它 们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙, 透明或亮黄绿色。 木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有C1酶、∝酶和纤维二 糖酶等。此外,木霉中含有较强的17-α羟化酶,常用于甾体转化。 (6)根霉( Rhizopus) 根霉生长时由营养菌丝产生匍匐枝,匍匐枝的末端生出假根,在有假根的匍匐枝上生 出成群的孢子囊梗,梗的顶端膨大形成孢子囊,囊內产生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或 不规则形状。根霉可用亍生产糖化酶、αˆ淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂 肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的11-羟化酶,是用于甾体转化的重 要菌株。 (7)毛霉( Mucor 毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延,无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗,一般 单生,分枝较少或不分枝。孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊,囊壁上常有针状的草酸 钙结晶 毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。 2.4酵母 (1)啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae) 啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭囻形到腊肠形。在麦芽 汁培养基上,菌落为白色,有光泽,平滑,边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊,毎个子 囊含有1~4个圆形光亮的子囊孢子
度的绿色，菌丝透明，有分隔，分枝繁复，分枝上可继续分枝，形成二级分枝、三级分枝， 分支末端为小梗，瓶状，束生、对生、互生或单生，分生孢子由小梗相继生出，靠粘液把它 们聚成球形或近球形的孢子头。分生孢子近球形、椭圆形、圆筒形或倒卵形。光滑或粗糙， 透明或亮黄绿色。 木霉是生产纤维素酶的重要菌株。木霉生产的纤维素酶中包含有 C1酶、Cx 酶和纤维二 糖酶等。此外，木霉中含有较强的 17 -α羟化酶，常用于甾体转化。 (6) 根霉(Rhizopus) 根霉生长时,由营养菌丝产生匍匐枝，匍匐枝的末端生出假根，在有假根的匍匐枝上生 出成群的孢子囊梗，梗的顶端膨大形成孢子囊，囊内产生孢子囊包子。孢子呈球形、卵形或 不规则形状。根霉可用于生产糖化酶、α-淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、核糖核酸酶、脂 肪酶、果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶等。根霉有强的 11-α羟化酶，是用于甾体转化的重 要菌株。 (7) 毛霉(Mucor) 毛霉的菌丝体在基质上或基质内广泛蔓延，无假根。菌丝体上直接生出孢子囊梗，一般 单生，分枝较少或不分枝。孢子囊梗顶端都有膨大成球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸 钙结晶。 毛霉常用于生产蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝乳酶等。 2.4 酵母 (1) 啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) 啤酒酵母是啤酒工业上广泛应用的酵母。细胞由圆形、卵形、椭圆形到腊肠形。在麦芽 汁培养基上，菌落为白色，有光泽，平滑，边缘整齐。营养细胞可以直接变为子囊，每个子 囊含有 1～4 个圆形光亮的子囊孢子
啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外,还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇 脱氢酶等的生产。 2)假丝酵母( Candida) 假丝酵母的细胞圆形,卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖,形成假菌丝,也有真菌丝, 可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上,菌落 呈乳白色或奶油色。 假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强 的17-羟基化酶,可以用于甾体转化 3.发酵工艺条件及其控制 ◆微生物发酵产酶的一般工艺流程如图2-7所示: 保藏细胞 细胞活化 生质体 固定化细胞 细胞扩大培养 固定化原生质体 发酵 预培养 培养基 无菌空气 分离纯化 酶 图2-7微生物发酵产酶的工艺流程 31细胞活化与扩大培养 保藏的菌种在用于发酵生产之前,必须接种于新鲜的固体培养基上在一定的条件下进
啤酒酵母除了主要用于啤酒、酒类的生产外，还可以用于转化酶、丙酮酸脱羧酶、醇 脱氢酶等的生产。 (2) 假丝酵母(Candida) 假丝酵母的细胞圆形，卵形或长形。无性繁殖为多边芽殖，形成假菌丝，也有真菌丝， 可生成无节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子。不产生色素。在麦芽汁琼脂培养基上，菌落 呈乳白色或奶油色。 假丝酵母可以用于生产脂肪酶、尿酸酶、尿囊素酶、转化酶、醇脱氢酶等。具有较强 的 17-羟基化酶，可以用于甾体转化。 3. 发酵工艺条件及其控制 ◆微生物发酵产酶的一般工艺流程如图 2-7 所示： 图 2-7 微生物发酵产酶的工艺流程 3.1 细胞活化与扩大培养 保藏的菌种在用于发酵生产之前，必须接种于新鲜的固体培养基上，在一定的条件下进 保藏细胞 细胞活化 细胞扩大培养 养 发酵 分离纯化 酶 原生质体 固定化细胞 固定化原生质体 培养基 预培养 无菌空气