上海交通大学通识教育立项核心课程 课程名称：生物技术与人类课程号：B913班级号： 397833 姓名： 张敏萱学号：518120910107专业： 经济管理试验班 课程小论文 题目 丝素蛋白的研究、制备和应用 得分 丝素蛋白的研究、制备和应用 张敏萱 (上海交通大学安泰经济与管理学院，上海，200240) 摘要：丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的机械性能 和理化性质，作为一种生物相容性优良的天然高分子材料有着广泛的应用。本文 介绍了丝素蛋白的组成结构、丝素蛋白膜的制备方法及其之间的异同，并且综述 了丝素蛋白作为生物材料的应用研究。 关键词：丝素蛋白；结构；酶水解；生物材料 The Research,Preparation and Application of Silk Fibroin ZHANG Minxuan (School of Economy and Management, Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200240,China) Abstract:Silk fibroin is a natural polymer fibrin extracted from silk.It has good mechanical properties and physical and chemical properties.It has a wide range of applications as a natural polymer material with excellent bioc ompatibility.This paper introduces the composition of silk fibroin,the prepa ration methods of silk fibroin film and their similarities and differences,and
上海交通大学通识教育立项核心课程 课程名称： 生物技术与人类 课程号： BI913 班级号： 397833 姓名： 张敏萱 学号： 518120910107 专业： 经济管理试验班 课程小论文 题目 丝素蛋白的研究、制备和应用 得分 丝素蛋白的研究、制备和应用 张敏萱 （上海交通大学安泰经济与管理学院，上海，200240） 摘 要：丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，具有良好的机械性能 和理化性质，作为一种生物相容性优良的天然高分子材料有着广泛的应用。本文 介绍了丝素蛋白的组成结构、丝素蛋白膜的制备方法及其之间的异同，并且综述 了丝素蛋白作为生物材料的应用研究。 关键词：丝素蛋白；结构；酶水解；生物材料 The Research, Preparation and Application of Silk Fibroin ZHANG Minxuan (School of Economy and Management, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China) Abstract: Silk fibroin is a natural polymer fibrin extracted from silk. It has good mechanical properties and physical and chemical properties. It has a wide range of applications as a natural polymer material with excellent bioc ompatibility. This paper introduces the composition of silk fibroin, the prepa ration methods of silk fibroin film and their similarities and differences, and
reviews the application of silk fibroin as a biomaterial. Keywords:Silk Fibroin;Structure;Enzymatic Hydrolysis;Biomaterial 1丝素蛋白简介 蚕丝是熟蚕结茧时所分泌的丝液凝固而 成的连续长纤维，也称天然丝，是一种天然 丝胶 纤维，是人类利用最早的动物纤维之一。根 丝 据蚕的食物的不同，又分桑蚕、柞蚕、木薯 图1蚕丝结构 蚕、樟蚕、柳蚕和天蚕等。蚕茧的化学组成主 要为：水分1.40%，灰分1.14%，蛋白质97.34%，醚溶性浸出物0.26%，纤维 0.39%。茧丝由两根单丝构成，每根单丝主要是由纤维状蛋白质丝素蛋白，外包以 另一种蛋白质丝胶蛋白粘结而成，此外还含少量油脂类、色素、无机物等，如图1 所示。其中丝素蛋白是一种角蛋白，是蚕丝的主体，约占蚕丝质量的70%~80%。 丝素蛋白是一种无生理活性的天然生物大分子，由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等18 种氨基酸以多缩氨键连接而成，通常认为其分子量约为3.7×10。 丝素蛋白在组成上由18种氨基酸构成，其中侧基较为简单的甘氨酸、丙氨 酸和丝氨酸约占总组成的85%，三者的摩尔比为4：3：1，且按一定序列结构排列 成较为规整的链段，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域：而带有较大侧基的 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非晶区域。除了C、H、O、N四种元素以 外，丝素蛋白和其他蛋白一样，还含有多种其他元素。科学家用质子诱导X发射 光谱对多种丝素蛋白进行研究，发现它还含有K、Ca、Si、Sr、P、Fe、Cu等元素， 这些元素对丝素蛋白的性能有直接影响，和蚕吐丝的机理等也有着直接的关系， 但具体的这些元素和丝素蛋白之间的相互关系在学界仍在探索之中。 在结构上，丝素蛋白是一种亚单元结构，由一条H链（长链），一条L链（短 链)和糖蛋白P25构成。丝素蛋白分子的构象可分为两类，分别为Si1kI和Si1k IⅡ结构。Si1kI结构包括无规则线团和a-螺旋，Si1kIⅡ结构为反平行U-折叠结构。 2017年刘永成、邵正中等用隧道扫描电镜(STM)得到了这两类构象及其中间状态 的图像，如图2所示
reviews the application of silk fibroin as a biomaterial. Keywords: Silk Fibroin; Structure; Enzymatic Hydrolysis; Biomaterial 1 丝素蛋白简介 蚕丝是熟蚕结茧时所分泌的丝液凝固而 成的连续长纤维，也称天然丝，是一种天然 纤维，是人类利用最早的动物纤维之一。根 据蚕的食物的不同，又分桑蚕、柞蚕、木薯 蚕、樟蚕、柳蚕和天蚕等。蚕茧的化学组成主 要为：水分 1.40%，灰分 1.14%，蛋白质 97.34%，醚溶性浸出物 0.26%，纤维 0.39%。茧丝由两根单丝构成，每根单丝主要是由纤维状蛋白质丝素蛋白，外包以 另一种蛋白质丝胶蛋白粘结而成，此外还含少量油脂类、色素、无机物等，如图 1 所示。其中丝素蛋白是一种角蛋白，是蚕丝的主体 ,约占蚕丝质量的 70%～80%。 丝素蛋白是一种无生理活性的天然生物大分子 ,由乙氨酸、丙氨酸、丝氨酸等 18 种氨基酸以多缩氨键连接而成，通常认为其分子量约为 3.7×10 5。 丝素蛋白在组成上由 18 种氨基酸构成，其中侧基较为简单的甘氨酸、丙氨 酸和丝氨酸约占总组成的 85%，三者的摩尔比为 4：3：1，且按一定序列结构排列 成较为规整的链段，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域；而带有较大侧基的 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非晶区域。除了 C、H、O、N 四种元素以 外，丝素蛋白和其他蛋白一样，还含有多种其他元素。科学家用质子诱导 X 发射 光谱对多种丝素蛋白进行研究，发现它还含有 K、Ca、Si、Sr、P、Fe、Cu 等元素， 这些元素对丝素蛋白的性能有直接影响，和蚕吐丝的机理等也有着直接的关系， 但具体的这些元素和丝素蛋白之间的相互关系在学界仍在探索之中。 在结构上，丝素蛋白是一种亚单元结构，由一条 H 链(长链)，一条 L 链(短 链)和糖蛋白 P25 构成。丝素蛋白分子的构象可分为两类，分别为 SilkⅠ和 Silk Ⅱ结构。SilkⅠ结构包括无规则线团和α-螺旋，SilkⅡ结构为反平行 U-折叠结构。 2017 年刘永成、邵正中等用隧道扫描电镜（STM）得到了这两类构象及其中间状态 的图像，如图 2 所示。 图 1 蚕丝结构
dmA 图2桑蚕丝腺体中部不同部位丝素蛋白的STM图像 相比于其他天然高分子，丝素蛋白具有明显的优越性，研究表明它具有良好 物理化学性能和优良的生物相容性，且无毒、无污染、无刺激性、可生物降解， 广泛应用于纺织、化妆品、生物医学材料、生物传感、食品工业等领域。长期以 来人们一直致力于研究开拓丝素蛋白应用的新领域。 2传统丝素蛋白膜的制备 蚕丝蛋白主要含有丝素和丝胶二种不同的蛋白质，制备丝素蛋白膜时，先经 脱胶后得到不溶性丝素蛋白，然后将丝素蛋白在一定的条件下水解即可制得可溶 性丝蛋白（丝素肽），从而得到丝素蛋白溶液，再烘干得到丝素蛋白膜。其提取工 艺流程是：蚕种场削口茧及下脚丝--丝素蛋白--水解--过滤提纯-滤液pH测试调 整-一浓缩-一灭菌一烘干-一成品。其中水解的过程是最为关键的一环。由于丝素蛋 白主要是由疏水性的氨基酸基团组成，分子间和分子内的氢键的相互作用很强， 因此不溶于大多数的溶剂如水、稀酸、稀碱等，但可以溶于较高浓度的盐溶液中。 对于丝素溶剂，国内外许多学者做了大量的研究，已有许多报道。Um(2001)等 使用甲酸来溶解丝素蛋白，所得到的溶液稳定、透明，没有分子聚集现象发生。 Li(2003)等使用9mol/L LiSCN溶液40℃下溶解丝素蛋白，得到稳定的丝素蛋 白溶液。Sofia(2001)等使用六氟-2-丙醇作溶剂溶解丝素蛋白，可得到浓度为 2%-3%澄清的丝素蛋白溶液。 传统的水解法有CaCl2-C,HOH-H0溶解法、LiBr溶解法、LiSCN溶解法、Ca(NO,)2 溶解法等。 2.1CaC12-CHs0H-H20溶解法 将脱胶后得到的丝素蛋白溶解在CaCl2-CH,0H-H,0溶液中，其中n(CaCl2): n(CH0H):n(H0)为1：2：8，在75℃下搅拌溶解。丝素蛋白的体积（单位为毫
图 2 桑蚕丝腺体中部不同部位丝素蛋白的 STM 图像 相比于其他天然高分子，丝素蛋白具有明显的优越性，研究表明它具有良好 物理化学性能和优良的生物相容性，且无毒、无污染、无刺激性、可生物降解， 广泛应用于纺织、化妆品、生物医学材料、生物传感、食品工业等领域。长期以 来人们一直致力于研究开拓丝素蛋白应用的新领域。 2 传统丝素蛋白膜的制备 蚕丝蛋白主要含有丝素和丝胶二种不同的蛋白质，制备丝素蛋白膜时，先经 脱胶后得到不溶性丝素蛋白，然后将丝素蛋白在一定的条件下水解即可制得可溶 性丝蛋白(丝素肽)，从而得到丝素蛋白溶液，再烘干得到丝素蛋白膜。其提取工 艺流程是：蚕种场削口茧及下脚丝--丝素蛋白--水解--过滤提纯--滤液 pH 测试调 整--浓缩--灭菌—烘干--成品。其中水解的过程是最为关键的一环。由于丝素蛋 白主要是由疏水性的氨基酸基团组成，分子间和分子内的氢键的相互作用很强， 因此不溶于大多数的溶剂如水、稀酸、稀碱等，但可以溶于较高浓度的盐溶液中。 对于丝素溶剂 ,国内外许多学者做了大量的研究 ,已有许多报道。Um（2001）等 使用甲酸来溶解丝素蛋白，所得到的溶液稳定、透明，没有分子聚集现象发生。 Li（2003）等使用 9mol/L LiSCN 溶液 40℃下溶解丝素蛋白，得到稳定的丝素蛋 白溶液。Sofia（2001）等使用六氟-2-丙醇作溶剂溶解丝素蛋白，可得到浓度为 2%-3%澄清的丝素蛋白溶液。 传统的水解法有 CaCl2-C2H5OH-H2O 溶解法、LiBr 溶解法、LiSCN 溶解法、Ca(NO3)2 溶解法等。 2.1 CaCl2-C2H5OH-H2O 溶解法 将脱胶后得到的丝素蛋白溶解在 CaCl2-C2H5OH-H2O 溶液中，其中 n（CaCl2）： n（C2H5OH）：n（H2O）为 1:2:8，在 75℃下搅拌溶解。丝素蛋白的体积（单位为毫
升)与溶解体系的质量（单位为克）的比为15，所得到的丝素蛋白溶液用去离子 水透析，直到用AgNO溶液检测不到C1-为止，将透析后的溶液放在0~4℃条件下 放置备用。 2.2LiBr溶解法 LiBr溶解法的溶解溶液可分为三种：一种是m(LiBr):m(CH,OH):m(H0) 的比为45：44：11；一种是m(LiBr):m(C2H0H)为40：60：一种是9.5mo1/L的 LiBr-H0水溶液。三种溶解体系都是在温度为4550℃下搅拌溶解丝素蛋白，丝 素蛋白的质量与溶解体系的质量比为3：40，得到的丝素蛋白溶液先用去离子水透 析3天，在用聚乙二醇水溶液浓缩6小时，得到高浓度的丝素蛋白水溶液。 2.3 LiSCN溶解法 将脱胶后的丝素蛋白放入浓度为9mol/L的LiSCN溶液中搅拌至完全溶解，其 中丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为30100， 将得到的丝素蛋白溶液用去离子水或者是5mo1/L的尿素水溶液透析约2小时， 得到丝素蛋白水溶液；或者是将丝素蛋白放入质量分数为6O%的LiSCN溶液中搅拌 溶解，丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为100， 溶解后的丝素蛋白溶液用20mmol/L的Tris-HC1和5mol/L的尿素水溶液透析，得 到丝素蛋白水溶液。 2.4Ca(N0,),溶解法 将脱胶后烘干的丝素蛋白放入Ca (NO)2CHOH-H20的体系中， m[Ca(NO)2·H0]:m(CHO)为3：1，加热溶解，至丝素蛋白完全溶解，然后用去离 子水透析，的丝素蛋白水溶液。 2.5传统丝素蛋白膜制备方法中存在的问题 传统方法制备过程中，需要的溶解体系主要为无机盐水溶液体系，并且操作 工艺较为复杂，溶解后需要较长时间的透析，丝素蛋白分子容易降解并且溶解效 果不好，得到的是一种容易发生凝胶的不稳定溶液体系，这些溶剂存在毒性高、 不稳定、溶解耗时、破坏蛋白结构、难回收等缺点。在溶解过程中高浓度的盐溶 液对丝素蛋白的结构破坏严重，使得所制得的再生丝素蛋白产品的机械性能较差
升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为 15，所得到的丝素蛋白溶液用去离子 水透析，直到用 AgNO3溶液检测不到 Cl-为止，将透析后的溶液放在 0~4℃条件下 放置备用。 2.2 LiBr 溶解法 LiBr 溶解法的溶解溶液可分为三种：一种是 m（LiBr）：m（C2H5OH）：m（H2O） 的比为 45:44:11；一种是 m（LiBr）: m（C2H5OH）为 40:60；一种是 9.5mol/L 的 LiBr- H2O 水溶液。三种溶解体系都是在温度为 45~50℃下搅拌溶解丝素蛋白，丝 素蛋白的质量与溶解体系的质量比为 3:40，得到的丝素蛋白溶液先用去离子水透 析 3 天，在用聚乙二醇水溶液浓缩 6 小时，得到高浓度的丝素蛋白水溶液。 2.3 LiSCN 溶解法 将脱胶后的丝素蛋白放入浓度为 9mol/L 的 LiSCN 溶液中搅拌至完全溶解，其 中丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为 30~100， 将得到的丝素蛋白溶液用去离子水或者是 5mol/L 的尿素水溶液透析约 2 小时， 得到丝素蛋白水溶液；或者是将丝素蛋白放入质量分数为 60%的 LiSCN 溶液中搅拌 溶解，丝素蛋白的体积（单位为毫升）与溶解体系的质量（单位为克）的比为 100， 溶解后的丝素蛋白溶液用 20mmol/L 的 Tris-HCl 和 5mol/L 的尿素水溶液透析，得 到丝素蛋白水溶液。 2.4 Ca(NO3)2溶解法 将脱胶后烘干的丝素蛋白放入 Ca(NO3)2-CH3OH- H2O 的体系中， m[Ca(NO3)2·H2O]:m(CH3OH)为 3:1，加热溶解，至丝素蛋白完全溶解，然后用去离 子水透析，的丝素蛋白水溶液。 2.5 传统丝素蛋白膜制备方法中存在的问题 传统方法制备过程中，需要的溶解体系主要为无机盐水溶液体系，并且操作 工艺较为复杂，溶解后需要较长时间的透析，丝素蛋白分子容易降解并且溶解效 果不好，得到的是一种容易发生凝胶的不稳定溶液体系，这些溶剂存在毒性高、 不稳定、溶解耗时、破坏蛋白结构、难回收等缺点。在溶解过程中高浓度的盐溶 液对丝素蛋白的结构破坏严重，使得所制得的再生丝素蛋白产品的机械性能较差
从而影响丝素蛋白产品的应用，这就限制了丝素蛋白更为广泛的应用。 3酶水解法制备再生丝素蛋白膜 传统的化学法制备丝素蛋白膜有以上缺点，故而科学家们研发出了另外一种 作用条件比较温和的水解方法一一酶水解法。和化学法的酸、碱、盐溶解法相比， 蛋白酶水解的作用条件更为温和，效率更高，并且不破坏原有蛋白质的氨基酸组 成。而且由于酶的高度专一性，使得我们能根据不同的应用需要，来制备不同的 多肽产品。 3.1溶剂对象 按照水解作用的方式，可将蛋白酶划分为两大类，一是肽链端解酶（又称外切 酶)，它从肽链骨架的一端逐个将氨基酸残基切下来，故它又可分为从羧基端开始 的羧肽酶和从氨基端开始的氨肽酶；另一类是肽键内切酶，这类酶水解时从肽链的 中间部位按照各自的特异性将肽键切断。显然，用内切酶水解大分子肽链时，更易 得到小分子肽片段。为此，我们在酶水解法制再生丝素蛋白膜实验中，均挑选内切 酶作为溶剂对象。 3.2酶水解法的过程 用酶水解法制备丝素蛋白膜的提取工艺流程与传统方法几乎相同，区别仅在 于水解过程中溶剂的配制与使用过程不同。 首先经过初步溶解和透析得到再生丝素液，然后配制酶母液。用万分之一克 电子天平准确称取所需酶制剂，用其活性相应p的缓冲液溶解。为保证其活力，临 用前配制。酶液的浓度以所加酶液体积不影响反应的总体积为标准进行适当调整。 将一定浓度的再生丝素液和相应缓冲液混合，微调至反应H值和反应所需温度后 加入酶母液进行反应。当反应到达预定时间后，迅速煮沸使酶失活。然后再经过 进一步的提纯过滤、灭菌、烘干，最终得到再生丝素蛋白膜成品。 4丝素蛋白的功能与应用 4.1丝素蛋白的优点 Altman等在2009年的研究中提出，丝素蛋白有如下优点： (1)与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；
从而影响丝素蛋白产品的应用，这就限制了丝素蛋白更为广泛的应用。 3 酶水解法制备再生丝素蛋白膜 传统的化学法制备丝素蛋白膜有以上缺点，故而科学家们研发出了另外一种 作用条件比较温和的水解方法——酶水解法。和化学法的酸、碱、盐溶解法相比， 蛋白酶水解的作用条件更为温和，效率更高，并且不破坏原有蛋白质的氨基酸组 成。而且由于酶的高度专一性，使得我们能根据不同的应用需要，来制备不同的 多肽产品。 3.1 溶剂对象 按照水解作用的方式,可将蛋白酶划分为两大类,一是肽链端解酶(又称外切 酶),它从肽链骨架的一端逐个将氨基酸残基切下来,故它又可分为从羧基端开始 的羧肽酶和从氨基端开始的氨肽酶;另一类是肽键内切酶,这类酶水解时从肽链的 中间部位按照各自的特异性将肽键切断。显然,用内切酶水解大分子肽链时,更易 得到小分子肽片段。为此,我们在酶水解法制再生丝素蛋白膜实验中,均挑选内切 酶作为溶剂对象。 3.2 酶水解法的过程 用酶水解法制备丝素蛋白膜的提取工艺流程与传统方法几乎相同，区别仅在 于水解过程中溶剂的配制与使用过程不同。 首先经过初步溶解和透析得到再生丝素液，然后配制酶母液。用万分之一克 电子天平准确称取所需酶制剂,用其活性相应 pH 的缓冲液溶解。为保证其活力,临 用前配制。酶液的浓度以所加酶液体积不影响反应的总体积为标准进行适当调整。 将一定浓度的再生丝素液和相应缓冲液混合，微调至反应 pH 值和反应所需温度后 加入酶母液进行反应。当反应到达预定时间后，迅速煮沸使酶失活。然后再经过 进一步的提纯过滤、灭菌、烘干，最终得到再生丝素蛋白膜成品。 4 丝素蛋白的功能与应用 4.1丝素蛋白的优点 Altman 等在 2009 年的研究中提出，丝素蛋白有如下优点： (1)与其他天然纤维和许多高性能合成纤维相比，有独特的力学性能；