活性,说明切除的肽链与活性无关,反之,切除的肽链与活性有关。 2.化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结 合、氧化或还原等修饰,称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有:-SH、-0H、 咪唑基、氨基、羧基、胍基等,用作修饰的试剂很多,目前已有七十多种,但专一性 的修饰剂不多 判断方法:某一基团被修饰后,酶的活性显著下降或无活性,可初步判断该基 团与酶的活性有关;反之,与酶的活性无关 缺点:也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的 正常空间结构,而导致酶活性的丧失。为排除这种可能,常在底物保护下用同一试剂 对酶作用,若不能被修饰,说明该基团确实处于活性部位;反之,底物存在下,该基 团可被同一试剂修饰,且使酶失活,在则该基团不是活性部位的基团,而是结构基团 根据修饰剂是否专一性结合藤的活性中心的特定基团,化学修饰可分为: (1)、非特异性共价共接修饰:修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合,又可 与酶的非活性部位的同一基团结合,称之为非特异性共价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位,在非活性部位不存在或极少存在。判断标 准是一:酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比;二:底物或竞争性抑制剂保护下可 防止修饰剂的抑制作用。 (2)、特异性的共价修饰:修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团,使酶失活。 如:DIFP(二异丙基氟磷酸)可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH而 使酶失活。DIFP一般不与蛋白质反应,也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应, 只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合 3.亲和标记法: 根据酶与底物能特异性的结合的性质,设计合成一种含反应基团的底物类似物,作 为活性部位的标记试剂,它能象底物一样进入酶的活性部位,并以其活泼的化学基团与 酶的活性基团的某些特定基团共价结合,使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为: N一对甲苯磺酰一L一苯丙氨酰乙酯或甲酯,根据此结构设计的亲和标记试剂为:N一对 甲苯磺酰一苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK) 4.X一射线衍射法: 把一纯酶的X一射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的X-射线图谱相比较,即可确 定酶的活性中心。 (四)酶的活性中心的一级结构 应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现,在酶的活性中心处 存在频率最髙的氨基酸残基是:丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨 酸和半胱氨酸。如果用冋位素标记酶的活性中心后,将酶水解,分离带标记 水解片段,对其进行一级结构测定,就可了解酶的活性中心的一级结构。 对各种蛋白水解酶进行类似的分析,功能类似的酶在一级结构上有惊人的相 似性。见下表所示 酶 氨基酸顺序 胰蛋白酶(牛 天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬 胰凝乳蛋白酶(牛) 丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮 弹性蛋白酶(猪) 丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮- 凝血酶(牛) 天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.苯丙 蛋白酶(S. griseus) 苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫
活性，说明切除的肽链与活性无关，反之，切除的肽链与活性有关。 2.化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链基团发生反应引起共价结 合、氧化或还原等修饰，称之为化学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、 咪唑基、氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十多种，但专一性 的修饰剂不多。 判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著下降或无活性，可初步判断该基 团与酶的活性有关；反之，与酶的活性无关。 缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的修饰而影响酶分子的 正常空间结构，而导致酶活性的丧失。为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂 对酶作用，若不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存在下，该基 团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团不是活性部位的基团，而是结构基团。 根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学修饰可分为： （1）、非特异性共价共接修饰：修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可 与酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非活性部位不存在或极少存在。判断标 准是一：酶活力的丧失程度与修饰剂的浓度成正比；二：底物或竞争性抑制剂保护下可 防止修饰剂的抑制作用。 （2）、特异性的共价修饰：修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶失活。 如：DIFP（二异丙基氟磷酸）可专一性地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH 而 使酶失活。DIFP 一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变性的酶反应， 只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。 3.亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种含反应基团的底物类似物，作 为活性部位的标记试剂，它能象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与 酶的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰凝乳蛋白酶最适底物为： N—对甲苯磺酰—L—苯丙氨酰乙酯或甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N—对 甲苯磺酰—苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）。 4.X—射线衍射法： 把一纯酶的 X—射线晶体衍射图谱与酶与底物反应后的 X-射线图谱相比较，即可确 定酶的活性中心。 (四)酶的活性中心的一级结构 应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究发现，在酶的活性中心处 存在频率最高的氨基酸残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、赖氨 酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性中心后，将酶水解，分离带标记 水解片段，对其进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一级结构。 对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的酶在一级结构上有惊人的相 似性。见下表所示： 酶 氨基酸顺序 胰蛋白酶（牛） 胰凝乳蛋白酶（牛） 弹性蛋白酶（猪） 凝血酶（牛） 蛋白酶（S.griseus） —天冬.丝,半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.缬- -丝.丝.半胱.甲硫.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮- -丝.甘.半胱.谷酰胺.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.亮- -天冬.丙.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.苯丙 -苏.半胱.谷.甘.天冬.丝.甘.甘.脯.甲硫
从上表可知,一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基酸几乎完全一样,而且这个活 性丝氨酸最邻近的5-6氨基酸顺序,从微生物到哺乳动物都一样,说明蛋白质活性中心在种 系进化上有严格的保守性。 二、酶的活性与高级结构的关系 酶的活性不仅与一级结构有关,而且与其高级结构密切相关。就某种程度而言,在酶的 活性表现上,高级结构甚至比一级结构更为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的保证, 高级结构破坏,酶失去活性 、酶原激活 有些酶在细胞内合成时,或初分泌时,没有催化活性,这种无活性状态的酶的前体称 为酶原( zymogen)。酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。酶原激活实际上是酶的活 性中心形成或暴露的过程 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活 性的酶原形式存在,在一定条件下才转化成相应的酶。 某些酶原的激活过程 酶原 激活条件 活化的酶水解掉的肽段 胃蛋白酶原胃蛋白 胃蛋白酶 六肽 肠激酶或 胰蛋白酶原 胰黛白 胰蛋白酶 六肽 胰蛋白酶 糜蛋白酶原A糜蛋白酶 α-糜蛋白酶 两个二肽 羧肽酶原A 胰蛋白酶 羧肽酶A 几个碎片 弹性蛋白酶原|胰蛋白酶 弹性蛋白酶 几个碎片 例如,胰蛋白酶原进入小肠后,受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活,第6位赖氨酸与第7 位异亮氨酸残基之间的肽键被切断,水解掉一个六肽,酶分子空间构象发生改变,产生酶的 活性中心,于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶 除消化道的蛋白酶外,血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的酶类,也都以酶原的形式存 在
从上表可知，一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基酸几乎完全一样，而且这个活 性丝氨酸最邻近的 5-6 氨基酸顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明蛋白质活性中心在种 系进化上有严格的保守性。 二、酶的活性与高级结构的关系 酶的活性不仅与一级结构有关，而且与其高级结构密切相关。就某种程度而言，在酶的 活性表现上，高级结构甚至比一级结构更为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的保证， 高级结构破坏，酶失去活性。 三、酶原激活 有些酶在细胞内合成时，或初分泌时，没有催化活性，这种无活性状态的酶的前体称 为酶原(zymogen)。酶原向活性的酶转化的过程称为酶原的激活。酶原激活实际上是酶的活 性中心形成或暴露的过程。 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活 性的酶原形式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。 某些酶原的激活过程 酶原 激活条件 活化的酶 水解掉的肽段 胃蛋白酶原 胃蛋白酶 六肽 胰蛋白酶原 胰蛋白酶 六 肽 糜蛋白酶原 A α-糜蛋白酶 两个二肽 羧肽酶原 A 羧肽酶 A 几个碎片 弹性蛋白酶原 弹性蛋白酶 几个碎片 例如，胰蛋白酶原进入小肠后，受肠激酶或胰蛋白酶本身的激活，第 6 位赖氨酸与第 7 位异亮氨酸残基之间的肽键被切断，水解掉一个六肽，酶分子空间构象发生改变，产生酶的 活性中心，于是胰蛋白酶原变成了有活性的胰蛋白酶。 除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白溶解的酶类，也都以酶原的形式存 在
OOOOOO画@ 高子链 武氢链 000000 胰蛋白元 活性中心 自由六 Sa LcQ000Q s-s 蛋白 胰蛋白酶原激活示意图 Chymotrypsinogen trypsinogen inactive) Inactive) 245167 Val-(Asp)4-Lys-lle- enteropeptidase >Val-(Asp)a-Lys 丌 Chymotrypsin Trypsin (active) (active) 11516 245 +Thr147-Asn a-Chymotrypsin (active) A 糜蛋白原的激活过程 胃蛋白辜原的激活过程
胰蛋白酶原激活示意图 糜蛋白酶原的激活过程 胃蛋白酶原的激活过程
胃蛋白原的激活过程 酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化,并可使酶 在特定的部位和环境中发挥作用,保证体内代谢的正常进行 第三节酶催化机理 酶的催化机理是解释酶催化特性的理论,如:酶为什么能催化化学反应、酶是如何催化 化学反应的、酶为什么有专一性、酶为什么有高效性等。 、酶为什么能催化化学反应 个化学反应要能够发生,关键的是反应体系中的分子必须具备一定能量即分子处于 活化状态,活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多,反应 就越快。因此,设法增加活化分子数量,是加快化学反应的唯一途径。增加反应体系的活化 分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量,如通过加热、加压、光照等,另一途径是 降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能,下图1所示 活化舞 非催化反应 的活化 催化反应的活化 初 全郁自由能 态 图1非催化过程和催化过程自由能的变化 二、酶如何降低化学反应的活化能中间产物学说 中间产物学说认为:酶在催化化学反应时,酶与底物首先形成不稳定的中间物,然后分 解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行,因而加快了 反应速度 S+E→ES P+E 底物酶中间产物产物 中间产物学说已经得到一些可靠的实验依据。如,用吸光法证明了含铁卟啉的过氧化物 酶参加反应时,单纯的酶的吸收光谱与加入了第一个底物HO2后确实产生了变化
胃蛋白酶原的激活过程 酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生的蛋白酶对细胞进行自身消化，并可使酶 在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。 第三节 酶催化机理 酶的催化机理是解释酶催化特性的理论，如：酶为什么能催化化学反应、酶是如何催化 化学反应的、酶为什么有专一性、酶为什么有高效性等。 一、酶为什么能催化化学反应 一个化学反应要能够发生，关键的是反应体系中的分子必须具备一定能量即分子处于 活化状态，活化分子比一般分子多含的能量就称为活化能。反应体系中活化分子越多，反应 就越快。因此，设法增加活化分子数量，是加快化学反应的唯一途径。增加反应体系的活化 分子数有两条途径:一是向反应体系中加入能量，如通过加热、加压、光照等，另一途径是 降低反应活化能。酶的作用就在于降低化学反应活化能，下图 1 所示 图 1 非催化过程和催化过程自由能的变化 二、酶如何降低化学反应的活化能 中间产物学说 中间产物学说认为：酶在催化化学反应时，酶与底物首先形成不稳定的中间物，然后分 解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行，因而加快了 反应速度。 S + E → ES → P + E 底物 酶 中间产物 产物 中间产物学说已经得到一些可靠的实验依据。如，用吸光法证明了含铁卟啉的过氧化物 酶参加反应时，单纯的酶的吸收光谱与加入了第一个底物 H2O2 后确实产生了变化
△G TB uncat 55 ESTEP Reaction coordinate 三、酶的高效性的解释 1、底物与酶的邻近效应和定向效应 底物分子的形变和扭曲 共价催化 4、酸碱催化 5、活性部位的微环境的影响 四、酶的专一性的解释 (一)锁与钥匙学说:如图所示 Actve Ei/ste+ →|E〉s (a) Lock-and-key model 锁与钥匙学说示意图
三、酶的高效性的解释 1、底物与酶的邻近效应和定向效应 2、底物分子的形变和扭曲 3、共价催化 4、酸碱催化 5、活性部位的微环境的影响 四、 酶的专一性的解释 （一）锁与钥匙学说：如图所示 锁与钥匙学说示意图