片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上1-2滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚)。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫 手为度)，促其干燥。 4、固定固定方法有2种： ()火焰固定将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过35次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 (2).化学固定血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中2-3m,取出沥干：或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用2-3min后，自然挥发干燥或沥干：抹片如作瑞氏染色(Wright's stain),则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强。 ③可能杀死抹片中的微生物 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹) 时，应亚格填重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 白、简单染色法只用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。 美蓝染色法：在己干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染 色液，经1-2mi,水洗，沥去多余的水分，用滤纸吸千或火焰上来回烘干（不能太热），镜 检。 四、作业 试述抹片固定的目的。 实验三细菌的革兰氏染色法
6 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上 95%酒精 2-3 滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上 1-2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片 材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚）。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥 上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫 手为度），促其干燥。 4、固定 固定方法有 2 种： ⑴.火焰固定 将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过 3-5 次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 ⑵.化学固定 血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中 2-3 min，取出沥干；或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用 2-3 min 后，自然挥发干燥或沥干；抹片如作瑞氏染色（Wright’s stain)，则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强。 ③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片 时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 ㈡、简单染色法 只用一种染料进行染色的方法，如美蓝染色法。 美蓝染色法：在已干燥、固定好的抹片上，滴加适量的（足够覆盖抹片点即可）美蓝染 色液，经 1-2 min，水洗，沥去多余的水分，用滤纸吸干或火焰上来回烘干（不能太热），镜 检。 四、作业 试述抹片固定的目的。 实验三 细菌的革兰氏染色法
一、实验目的要求 1.掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。 2.认识细菌革兰氏染色反应特性。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、 洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 1、玻片准备新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次， 表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上95%酒精2-3滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上12滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚)。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等 3、干燥上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为 度)，促其干燥。 4、固定固定方法有2种： ().火焰固定将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过3-5次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 (2).化学固定血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将己干燥的抹片浸入甲醇中2-3mi,取出沥干：或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用2-3min后，自然挥发干燥或沥干：抹片如作瑞氏染色(Wright's stain)),则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强
7 一、实验目的要求 1．掌握细菌抹片的制备方法和革兰氏方法。 2．认识细菌革兰氏染色反应特性。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、95%酒精、草酸铵结晶紫染色液、革兰氏碘溶液、碱性复红液、玻片、纱布、染色缸、 洗瓶、吸水纸、试管架、二甲苯、擦镜纸、香柏油、火柴。 三、实验方法及步骤 1、玻片准备 新玻片或用后的玻片，应按附录一中（二）的方法处理后才用。用过很多次， 表面已有许多划痕的玻片应废弃。 手持玻片时，应以拇指、食指或中指夹住载玻片上下两边缘，以免表面粘上手印。载玻 片应清晰透明而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，用玻璃铅笔容易画上记号。如 有残余油渍，可滴上 95%酒精 2-3 滴，用清洁纱布揩擦，然后在酒精灯火焰上轻轻通过几次。 若仍未能除去油渍，可再滴上 1-2 滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。 2、抹片 材料不同，抹片方法有差异。 液体材料如液体培养物、血液、渗出液、乳汁等，可直接用灭菌接种环取一环材料，于 玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。 固体材料如菌落、脓粒、粪便等，则应先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于 玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量材料，在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层（不 宜太厚）。 组织脏器材料：先用镊子夹持局部，然后以灭菌或洁净剪刀剪取一小块，夹出后以其新 鲜切面在玻片上压印或涂抹成一薄层。 如有多个样品同时需要制成抹片，只要染色方法相同，可以在同一张玻片上，先用蜡笔 在玻片上划分成若干小方格，每方格涂抹一种样品。需要保留的标本，应先做好标记，待标 本染色后贴上标签，注明菌名、材料、染色方法和制片日期等。 3、干燥 上述涂好的抹片，应让其自然干燥或在酒精灯火焰上拖过以适当加温（以不烫手为 度），促其干燥。 4、固定 固定方法有 2 种： ⑴.火焰固定 将干燥好的抹片，使涂抹面向上，以其背面在酒精灯火焰上以钟摆的速度 来回通过 3-5 次，略作加热（但不能太热或烧灼，以手背能忍受为度），进行固定。 ⑵.化学固定 血液、组织脏器等抹片要作姬姆萨染色(Giemsa stain)时，不用火焰固定而 用甲醇固定。可将已干燥的抹片浸入甲醇中 2-3 min，取出沥干；或者在抹片上滴加数滴甲醇， 使其作用 2-3 min 后，自然挥发干燥或沥干；抹片如作瑞氏染色（Wright’s stain)，则不必先作 上述固定，因染色液中含有甲醇，可以达到固定的目的。 抹片固定的目的在于： ①使抹片除去水分，很好地贴附在玻片上，以免被水洗时冲掉。 ②使抹片易于着色或更好地着色，因为死菌比活菌着色力强
③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片 时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 白、染色革兰(Gram)氏染色法 (1)在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2mn,水洗。这时细菌 都染成紫色。 (2)加革兰氏碘溶液于抹片上助染，作用1-3m,水洗。这时细菌都呈更深的紫色。 (3)加95%酒精于抹片上脱色，约30s至1min,水洗。这时有的细菌紫色被脱去，呈无色： 有的紫色脱不了，仍保持紫色。 (4)加碱性复红液复染10-30s,水洗。这时己脱色的细菌复染成红色，未脱色的细菌呈蓝 紫色。 (⑤)吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色 四、作业 试述革兰氏染色的关键步骤。 实验三细菌的分离培养及培养性状观察 一、实验目的要求 1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2.了解厌氧菌的分离培养原则及常用的几种分离培养法。 3.了解细菌在固体和液体培养基中的生长表现。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、平皿、精密pH试纸、试管架、火柴。 三、实验方法及步骤 细菌分离培养和移植的一般原则 分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养的步骤：先从被检材料或病料中分离培养 单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。进行细菌分离培养和移 植应注意下列事项： 1.选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合 其生长的培养基以及所需的气体与培养温度（病原南菌一般为37℃）等。 2.严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌：操作时必须靠近火焰
8 ③可能杀死抹片中的微生物。 必须注意：在抹片固定过程中，实际上并不保证能杀死全部细菌，也不能完全避免在染 色水洗时会将部分材料冲脱，因此，在制备烈性病原菌，特别是带芽孢的病原菌的染色抹片 时，应严格慎重处理染色用过的残液和抹片本身，以免引起病原的散播。固定好的抹片，即 可进行各种方法的染色。 ㈡、染色 革兰（Gram）氏染色法 ⑴在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经 1-2min，水洗。这时细菌 都染成紫色。 ⑵加革兰氏碘溶液于抹片上助染，作用 1-3 min，水洗。这时细菌都呈更深的紫色。 ⑶加 95%酒精于抹片上脱色，约 30s 至 1 min,水洗。这时有的细菌紫色被脱去，呈无色； 有的紫色脱不了，仍保持紫色。 ⑷加碱性复红液复染 10-30 s，水洗。这时已脱色的细菌复染成红色，未脱色的细菌呈蓝 紫色。 ⑸吸干或烘干，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 四、作 业 试述革兰氏染色的关键步骤。 实验三 细菌的分离培养及培养性状观察 一、实验目的要求 1．掌握需氧菌分离培养的基本要领。 2．了解厌氧菌的分离培养原则及常用的几种分离培养法。 3．了解细菌在固体和液体培养基中的生长表现。 二、实验用品 隔水式恒温培养箱、电冰箱、高压蒸汽灭菌器、天平、接种环、酒精灯、试管、营养琼 脂、平皿、精密 pH 试纸、试管架、火柴。 三、实验方法及步骤 细菌分离培养和移植的一般原则 分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养的目的在于从被检材料中，或者从污 染的众多杂菌中分离出纯的病原菌。细菌分离培养的步骤：先从被检材料或病料中分离培养 单个菌落，然后钓取可疑菌落进行纯培养，再将纯培养物移植培养。进行细菌分离培养和移 植应注意下列事项： 1．选择适当培养基和培养条件。分离培养前应充分考虑所分离的细菌的特性，选择适合 其生长的培养基以及所需的气体与培养温度（病原菌一般为 37℃）等。 2．严格无菌操作、防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰
接种环必须经火焰彻底灭菌：操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精 灯火焰灭菌。 3.防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细 菌材料，否则会将细菌烫死：另外，还应注意防止己钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将 细菌杀死。 4.纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。 细菌的分离培养法 (一)需氧菌分离培养法 1.平板划线法此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散， 以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。 术式：右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸入酒精灯火焰中烧至通红， 再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料：左手取琼脂平板，琼脂面与水平 面成45°角，接种环同培养基平面也成45°角。靠近酒精灯火焰操作。 方法：接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实5-2中所示的几种划 线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线， 以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材 料名称及日期，倒转置37℃恒温箱中培养。 2.倾注法取3支预先准备的普通琼脂培养基管，水浴加热融化，冷至约50℃，用火 焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第1管内，充分摇匀后，自第1管取一接种环内容物至第 2管，以同样方法自第2管移种至第3管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置 温箱内培养。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落。仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板 内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。此法目前已较少应用 (二)厌氧菌分离培养法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在，故在培养厌氧菌时， 必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前，应用于厌 氧菌的分离培养方法颇多，现就其中较简便的几种方法介绍如下：
9 接种环必须经火焰彻底灭菌；操作完毕后，防止再让培养基接触外界空气，接种环通过酒精 灯火焰灭菌。 3．防止过热的接种环杀死需要分离培养的细菌。接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细 菌材料，否则会将细菌烫死；另外，还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将 细菌杀死。 4．纯化分离菌。初代分离时若长出两种以上菌落，应进一步挑选可疑菌落进行纯培养。 细菌的分离培养法 （一）需氧菌分离培养法 1．平板划线法 此法为最常用的细菌分离培养方法，其原则在于使被检材料充分分散， 以便经过培养后得到单个菌落，并可对菌落的形态、颜色、溶血与否等进行观察。 术式：右手似持毛笔的姿势持接种棒的塑料柄处，将接种环伸入酒精灯火焰中烧至通红， 再缓慢将接种棒其余金属部分均加以烧灼，准备蘸取材料；左手取琼脂平板，琼脂面与水平 面成 45°角，接种环同培养基平面也成 45°角。靠近酒精灯火焰操作。 方法：接种环经烧灼灭菌、冷却后，蘸取欲分离材料少许，按图实 5-2 中所示的几种划 线方式，选择其中一种进行划线。注意不要划破琼脂，不要划得太疏，不要过多重复划线， 以免形成菌苔。划毕，将培养基用皿盖盖好，接种环烧灼灭菌，于皿底用蜡笔标记被分离材 料名称及日期，倒转置 37℃恒温箱中培养。 2．倾注法 取 3 支预先准备的普通琼脂培养基管，水浴加热融化，冷至约 50℃，用火 焰灭菌接种环钓取待分离物接种至第 1 管内，充分摇匀后，自第 1 管取一接种环内容物至第 2 管，以同样方法自第 2 管移种至第 3 管。然后分别倾注一个已灭菌的平皿，凝固后倒转置 温箱内培养。结果多数细菌在琼脂内生长成菌落．仅少数菌落出现在表面，通常第一个平板 内的菌落数较多而密集，第二、三个平板则逐渐减少，可见单个菌落。此法目前已较少应用。 （二）厌氧菌分离培养法 厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在，故在培养厌氧菌时， 必须创造一个厌氧环境，一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前，应用于厌 氧菌的分离培养方法颇多，现就其中较简便的几种方法介绍如下：