三、实验材料 小鼠(30克)取肝脏 四、实验器材 同实验七外加 eppendorf管、微量进样器、tp头、台式高速 冷冻离心机。 五、实验药品 匀浆介质(0.25moL蔗糖+O. olmo/LTs盐酸缓冲液 H74),乙醇:冰乙酸(3:1),生理盐水,姬姆萨染液,中性红一 詹纳斯绿染液(称取004g中性红、0.02g詹姆斯绿溶于100ml, 0.25mo/L蔗糖溶液中)。 其中0.01mo/Tris一盐酸缓冲液配法:0 Imol/L三羟甲基氨 基甲烷(TIi)oml,0.lmo盐酸84ml加蒸馏水至100ml 六、实验步骤 1低速离心分离细胞核 (1)将饥饿24小时的小白鼠放入容器中麻醉致死,立即剪开腹部,迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污,用滤纸吸干。, (2)称取05g肝组织,放在小烧杯中剪碎,用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用4层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至 Corex离心管中,同时制 备1张滤液涂片,做好标记,自然干燥。 (4漓心机上500r/min离心5min(4℃),将上层溶液吸入2支 eppendof管中,盖紧盖子放在有冰块的器皿内,待分离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理 (5)用5m匀浆介质悬浮离心下的沉淀物,用吸管混匀,以 l00o/min离心 10min(4℃),吸去上清液,用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余的沉淀物加入0.3-05m匀浆介质 用吸管吹打成悬液,再制备一张涂片做好标记,自然干燥。 2.高速离心分离线粒体 (1)将步骤W4)中的 eppendof管在台式高速冷冻离心机上以 1000/min离心5min,缓缓吸出上清液至另2 eppendorf管,留 取沉淀物冰浴保存,待涂片鉴定。 (2)另2支上清液在台式高速冷冻离心机上以13000r/min离心 5mn。 6
6 三、实验材料 小鼠(30 克)取肝脏 四、实验器材 同实验七 外加 eppendorf 管、微量进样器、tip 头、台式高速 冷冻离心机。 五、实验药品 匀浆介质(0.25mol/L 蔗糖＋O．Olmol/LTris-盐酸缓冲液 pH7.4)，乙醇：冰乙酸(3：1)，生理盐水，姬姆萨染液，中性红一 詹纳斯绿染液(称取 0.04g 中性红、0.02g 詹姆斯绿溶于 l00ml， 0.25mol/L 蔗糖溶液中)。 其中 0.01mo/LTris－盐酸缓冲液配法：0.lmol/L 三羟甲基氨 基甲烷(Tris)10ml， 0.1mol/L 盐酸 8.4ml 加蒸馏水至 100ml。 六、实验步骤 1.低速离心分离细胞核 (1)将饥饿 24 小时的小白鼠放入容器中麻醉致死，立即剪开腹部，迅 速取出肝组织浸入预冷的生理盐水中洗去血污，用滤纸吸干。， (2)称取 0.5g 肝组织，放在小烧杯中剪碎，用少量预冷的匀浆介质 洗涤数次。 (3)将烧杯内悬浮组织倒入玻璃匀浆器中进行冰浴匀浆。用 4 层 纱布(先用少量匀浆介质湿润)过滤匀浆液至 Corex 离心管中，同时制 备 l 张滤液涂片，做好标记，自然干燥。 (4 漓心机上 500r／min 离心 5min(4℃)，将上层溶液吸入 2 支 eppendof 管中，盖紧盖子放在有冰块的器皿内，待分离线粒体时用。 沉淀物作进一步处理。 (5)用 5ml 匀浆介质悬浮离心下的沉淀物，用吸管混匀，以 1000r／min 离心 10min(4℃)，吸去上清液，用吸管吸出少量沉淀 物上层涂片。剩余的沉淀物加入 0.3-0.5ml 匀浆介质， 用吸管吹打成悬液，再制备一张涂片做好标记， 自然干燥。 2. 高速离心分离线粒体 (1)将步骤 l(4)中的 eppendof 管在台式高速冷冻离心机上以 10000r／min 离心 5min，缓缓吸出上清液至另 2 eppendorf 管，留 取沉淀物冰浴保存，待涂片鉴定。 (2) 另 2 支上清液在台式高速冷冻离心机上以 13000r／min 离心 5min
(3)吸去上清液,沉淀物置冰浴中,待制片鉴定时用。 3.分离物的鉴定 (1)细胞核。将步骤1中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定 l5min,吹干,滴姬姆萨染液(原液用1/15mol磷酸缓冲液 稀释10-20倍)染色10min,自来水冲洗,吹干,在高倍镜 下比较观察涂片 (2)线粒体。在2张干净载玻片中央各滴2—3滴中性红一詹纳斯 绿染液,取步骤2高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片 上,染色3min后分别盖上盖玻片,在高倍镜下观察。附:更精致的分离方 案 将45ml0.34mol/L蔗糖溶液放入离心管,然后沿壁小心地加入 45ml鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以700×g离心 l0min,得上清液Ⅰ和沉淀物。沉淀物用10ml0.25mol/L蔗糖溶液洗2 次,每次1000×g离心10min,得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集 质膜:吸出沉淀中较疏松的上层,混悬于比重为1.16的蔗糖溶液中,沿 管壁小心加入已放在离心管中的比重1.18的蔗糖溶液的上层,经700 ×g离心10min,质膜最终集中在两溶液界面上,吸出质膜层。(2)细胞 核纯化:将沉淀用5倍体积的0.34mol/L蔗糖0.5mo/LMg(Ac)溶 液混悬,铺在4倍于核悬液体积的0.88m0I/L蔗糖-0.5mol/L Mg(Ac)2溶液之上,1500×g离心20min,沉淀物即为纯化的细胞核。 (3)分离核仁:纯化的细胞核混悬在2倍体积的034mol/L蔗糖一 0.5mol/LMg(Ac)溶液中,超声波破核膜,释放出核仁,注意蔗糖介质 pH中性或弱碱性时核膜才易破碎,超声后的悬液铺于4倍体积的 0.88mol/L蔗糖—0.5mol/LMg(Ac)溶液之上,1700×g离心17min 沉淀物即为核仁,溶液为上清液I。 将上清液I10000Xg离心 lOmin得上清液Ⅱ和沉淀物,沉淀物以 IOml预冷的025mol/L蔗糖溶液洗2次,每次10000×g离心10min, 得沉淀物即为纯化的线粒体。 上清液Ⅱ经16300×g离心20min得上清液Ⅲ和沉淀物,沉淀物 以Iom预冷的0.25m01/L蔗糖溶液洗:16300×g离心20min,得沉淀 物即为纯化的溶酶体。 上清液Ⅲ经100000Xg离~30min,得沉淀物(为微粒体)和上清 液Ⅳ,后者再经离心150000×g3h左右可获得核糖体、病毒、生物大分 子等
7 (3)吸去上清液，沉淀物置冰浴中，待制片鉴定时用。 3．分离物的鉴定 (1)细胞核。将步骤 l 中得到的涂片浸入乙醇一冰醋酸中固定 15min，吹干，滴姬姆萨染液(原液用 1／15mol 磷酸缓冲液 稀释 10—20 倍)染色 10min，自来水冲洗，吹干，在高倍镜 下比较观察涂片。 (2)线粒体。在 2 张干净载玻片中央各滴 2—3 滴中性红—詹纳斯 绿染液，取步骤 2 高速离心得到两份沉淀物分别均匀地涂布在玻片 上，染色 30min 后分别盖上盖玻片，在高倍镜下观察。附：更精致的分离方 案 将 4.5ml0.34mol／L 蔗糖溶液放入离心管，然后沿壁小心地加入 4.5ml 鼠肝匀浆使覆盖于上层。用高速冷冻离心机以 700×g 离心 10min，得上清液 I 和沉淀物。沉淀物用 10ml 0.25mol／L 蔗糖溶液洗 2 次，每次 1000×g 离心 10min，得到的沉淀物可进行以下处理。(1)收集 质膜：吸出沉淀中较疏松的上层，混悬于比重为 1.16 的蔗糖溶液中，沿 管壁小心加入已放在离心管中的比重 1.18 的蔗糖溶液的上层，经 700 ×g 离心 10min，质膜最终集中在两溶液界面上，吸出质膜层。（2）细胞 核纯化：将沉淀用 5 倍体积的 0.34mol／L 蔗糖 0.5mol／LMg(Ac)2 溶 液混悬，铺在 4 倍于核悬液体积的 0.88m01'／L 蔗糖—0.5mol／L Mg(Ac)2 溶液之上，1500×g 离心 20min，沉淀物即为纯化的细胞核。 （3）分离核仁：纯化的细胞核混悬在 2 倍体积的 0.34mol／L 蔗糖— 0.5mol／LMg(Ac)2 溶液中，超声波破核膜，释放出核仁，注意蔗糖介质 pH 中性或弱碱性时核膜才易破碎，超声后的悬液铺于 4 倍体积的 0.88mol／L 蔗糖—0.5moI／LMg(Ac)2 溶液之上，1700×g 离心 17min。 沉淀物即为核仁，溶液为上清液 I。 将上清液 I 10000×g 离心 lOmin 得上清液Ⅱ和沉淀物，沉淀物以 lOml 预冷的 0.25mol／L 蔗糖溶液洗 2 次，每次 10000×g 离心 10min， 得沉淀物即为纯化的线粒体。 上清液Ⅱ经 16 300×g 离心 20min 得上清液Ⅲ和沉淀物，沉淀物 以 lOml 预冷的 0.25m01／L 蔗糖溶液洗；16300×g 离心 20min，得沉淀 物即为纯化的溶酶体。 上清液Ⅲ经 100 000Xg 离~~'30min，得沉淀物(为微粒体)和上清 液Ⅳ，后者再经离心 150000×g 3h 左右可获得核糖体、病毒、生物大分 子等