第十四章动植物细胞培养 动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。动植物细胞培养与微生 物细胞培养有很大的不同(表14-1)。由于动物细胞无细胞壁,且大多数哺乳动物细胞附着 在固体或半固体的表面才能生长:对营养要求严格,除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半 乳糖外,还需有血清。动物细胞对环境敏感,包括p值、溶氧、CO2、温度、剪切应力都比 微生物有更严的要求,一般须严格的监测和控制。相比之下,植物细胞对营养要求较动物细 胞简单。但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物,而且植物细胞 生长较微生物要缓慢,因此长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求。 在生物技术中,人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白 质、氨基酸等产物,但是很多有重要价值的生物物质,如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体 色素、香味物质等,必须借助于动、植物细胞的大规模培养来获得。从20世纪50年代以来, 这方面已取得一些进展。但是,目前的技术还远不能满足细胞生物产品应用的要求,随着动 植物培养技术研究的深入,显示出广阔的发展前景。 表14-1动植物、微生物细胞的培养特征 种类 微生物 动物细胞 植物细胞 比较项目 1~10um 10~100um 10~100um 悬浮生长 多数细胞需附着表面可以,但易结团,无 才能生长 单个细胞 营养要求 简单 非常复杂 较复杂 生长速率 快,倍增时间0.5-5小慢,倍增时间15-100慢,倍增时间24-74 时 小时 代谢调节 内部 内部、激素 内部、激素 环境敏感 不敏感 非常敏感 能忍受广泛范围 细胞分化 有 剪切应力敏感 非常高 传统变异,筛选技术|广泛使用 不常使用 有时使用 细胞或产物浓度 第一节动物细胞大规模培养技术 动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年,美国生物学家 Harrison在无菌条件下,以淋 巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周,创立了体外组织培养法。1962 年,其规模开始扩大,随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善,动 物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技 术方法,利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等,已成为 医药生物高技术产业的重要部分。其发展简史见表14-2 利用动物细胞培养技术生产的生物制品己占世界生物高技术产品市场份额的50%。大量 资料表明,生物技术药物是当前新药开发的重要领域,生物技术制药工业是下一个10年制药 工业的重要新门类,期间将有数百种生物技术新药上市。美国最新预测几种畅销基因工程药 物2000年全球销售额EPO大于30亿美元,G2CSF大于20亿美元,HGH、IFN、UK均大于10亿美元 胰岛素和降钙素大于5亿美元。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节 目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培 养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上
第十四章 动植物细胞培养 动植物细胞培养是指动、植物细胞在体外条件下的存活或生长。动植物细胞培养与微生 物细胞培养有很大的不同（表 14-1）。由于动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着 在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半 乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括 pH 值、溶氧、C02、温度、剪切应力都比 微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。相比之下，植物细胞对营养要求较动物细 胞简单。但植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，而且植物细胞 生长较微生物要缓慢，因此长时间的培养对无菌条件及反应器的设计具有特殊的要求。 在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白 质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、 色素、香味物质等，必须借助于动、植物细胞的大规模培养来获得。从 20 世纪 50 年代以来， 这方面已取得一些进展。但是，目前的技术还远不能满足细胞生物产品应用的要求，随着动 植物培养技术研究的深入，显示出广阔的发展前景。 表 14-1 动植物、微生物细胞的培养特征 种类 比较项目 微生物 动物细胞 植物细胞 大 小 悬浮生长 营养要求 生长速率 代谢调节 环境敏感 细胞分化 剪切应力敏感 传统变异，筛选技术 细胞或产物浓度 1~10μm 可以 简单 快，倍增时间0.5~5小 时 内部 不敏感 无 低 广泛使用 较高 10~100μm 多数细胞需附着表面 才能生长 非常复杂 慢，倍增时间15~100 小时 内部、激素 非常敏感 有 非常高 不常使用 低 10~100μm 可以，但易结团，无 单个细胞 较复杂 慢，倍增时间24~74 小时 内部、激素 能忍受广泛范围 有 高 有时使用 低 第一节 动物细胞大规模培养技术 动物细胞体外培养的历史可追溯到1907年，美国生物学家Harrison在无菌条件下，以淋 巴液为培养基成功地在试管中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。1962 年，其规模开始扩大，随着细胞生物学、培养系统及培养方法等领域的不断丰富和完善，动 物细胞培养技术得到了很大的发展。发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技 术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为 医药生物高技术产业的重要部分。其发展简史见表14-2。 利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的50%。大量 资料表明，生物技术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个10年制药 工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市。美国最新预测几种畅销基因工程药 物2000年全球销售额EPO大于30亿美元,G2CSF大于20亿美元,HGH、IFN、UK均大于10亿美元, 胰岛素和降钙素大于5亿美元。动物细胞大规模培养技术是生物技术制药中非常重要的环节。 目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在培养规模的进一步扩大、优化细胞培 养环境、改变细胞特性、提高产品的产率与保证其质量上
表14-2动物细胞培养技术的发展 技术发展概要 1907年| Harrison创立体外组织培养法 1951年| Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基 1957年 Graff灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的1×10°~2×10 cells/L的记录,标志着现代灌注概念的诞生。 1962年| Castile成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞(BH),标志着动物细胞大规模培养 技术的起步。 1967年| Van Wezel用DEAE- Sephadex a50为载体培养动物细胞获得成功。 1975年Sato等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成 功,预示着无血清培养技术的诱人前景。 1975年| Kohler和 MIlstein成功地融合了小鼠B淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预 定单克隆抗体的杂交瘤细胞 1986年| DemoBiotech公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单抗获得成功。 1989 Konstantinovi首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制,更新了传统细 胞培养工艺中优化控制之理论 、动物细胞形态 (1)成纤维细胞型( fibroblast或 mechanocyte type)这种细胞形态与体内成纤维细胞 形态相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2~3个 长短不同的突起。细胞群常借原生质突连接成网,生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行[如 图14-1(a)]。除真正的纤维细胞外,凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞,如血管内皮 心肌、平滑肌、成骨细胞等,也多呈成纤维细胞形态。实际上很多所谓成纤维细胞并无产生 纤维的能力,只是一种习惯上概括的称法 (2)上皮细胞型( epithilium cell type)这种细胞呈扁平的不规则三角形,中央有圆 形核,生长时常彼此紧密连接单层细胞片[如图14-1(b)],起源于外胚层和内胚层组织的细 胞,如皮肤表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。培养时皆 呈上皮型 (3)游走细胞型( wondering cell type)这种细胞的培养需要在支持物上生长,一般不 连接成片,细胞胞质经常出现伪足或突起,呈活跃的游走和变形运动,速度快而且方向不规 则[如图14-1(c)]。此型细胞不很稳定,有时亦难和其他型细胞相区别,在一定条件下,如 培养基化学性质变动等,它们也可能变为成纤维细胞型 (4)多形性细胞型( polymorphic cell type)除上述三种细胞外,还有一些组织和细胞 如神经组织的细胞等,难以确定它们的稳定形态,可统归多形性细胞[如图14-1(d 上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞,培养这类细胞时,常需贴附在支持物上生 长。但由于培养环境的变化,细胞形态常发生改变。 (5)悬浮型细胞这类细胞常呈圆形,不贴附在支持物上,呈现悬浮状态生长。如血液细 胞,淋巴组织细胞及肿瘤细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。 、动物细胞培养基组成及制备 培养基的组成 动物细胞培养的培养基分为天然培养基和合成培养基两大类。天然培养基使用最早,营 养成分高,也最为有效。但成分复杂,个体差异大,来源也缺乏,因而使用受到限制。动物 血清是细胞培养中用量最大的天然培养基,血清含有丰富的营养物质,包括大分子蛋白质和
表14-2 动物细胞培养技术的发展 年份 技术发展概要 1907年 1951年 1957年 1962年 1967年 1975年 1975年 1986年 1989 Harrison创立体外组织培养法。 Earle等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。 Graff用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的1×1010～2×1010 cells/L的记录，标志着现代灌注概念的诞生。 Capstile成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞(BHK)，标志着动物细胞大规模培养 技术的起步。 Van Wezel用DEAE-Sephadex A 50 为载体培养动物细胞获得成功。 Sato等在培养基中用激素代替血清使垂体细胞株GH3在无血清介质中生长获得成 功，预示着无血清培养技术的诱人前景。 Kobhler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预 定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 DemoBiotech公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞生产单抗获得成功。 Konstantinovti首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制，更新了传统细 胞培养工艺中优化控制之理论 一、动物细胞形态 (1)成纤维细胞型(fibrlblast或mechanocyte type) 这种细胞形态与体内成纤维细胞 形态相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出 2～3 个 长短不同的突起。细胞群常借原生质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行[如 图 14-l(a)]。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、 心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。实际上很多所谓成纤维细胞并无产生 纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法。 (2)上皮细胞型(epithilium cell type) 这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆 形核，生长时常彼此紧密连接单层细胞片[如图 14-1(b)]，起源于外胚层和内胚层组织的细 胞，如皮肤表皮及衍生物(汗腺、皮脂腺等)。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。培养时皆 呈上皮型。 (3)游走细胞型(wondering cell type) 这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不 连接成片，细胞胞质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规 则[如图 14-1(c)]。此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如 培养基化学性质变动等，它们也可能变为成纤维细胞型。 (4)多形性细胞型(polymorphic cell type) 除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞， 如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞[如图 14-1(d)]。 上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生 长。但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变。 (5)悬浮型细胞这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细 胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。 二、动物细胞培养基组成及制备 1、培养基的组成 动物细胞培养的培养基分为天然培养基和合成培养基两大类。天然培养基使用最早，营 养成分高，也最为有效。但成分复杂，个体差异大，来源也缺乏，因而使用受到限制。动物 血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，血清含有丰富的营养物质，包括大分子蛋白质和
核酸等,对动物细胞的生长繁殖具有促进作用。同时,血清对细胞贴壁和保护亦有明显作用, 且能中和有毒物质的毒性,使细胞不受伤害。 图14-1动物细胞形态 (a)成纤维细胞型:(b)上皮细胞型:(c)游走细胞型:(d)多形性细胞型 合成培养基是根据天然培养基的成分,用化学物质模拟合成的,具有一定的组成。但这 种模拟不是被动和不加选择的,而是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的 人工合成培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基无法相比的优点。它给细胞提供了 个近似体内生存环境,又便于控制和标准化的体外生存环境。目前所有细胞培养室都己采用 经标准化生产、组份和含量都相对固定的各种合成培养基,如 Eagle基本培养基和更复杂的 NCTC109,TC199,HEM,DE,RPMI1640, McCoy5A,HAMF12等。尽管现代的合成培养基成份 和含量已经较为复杂,但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要。在合成培养基中都或 多或少的要加入一定比例的灭然培养基加以补充。目前多采用胎牛血清、小牛血清、马血清 等,比例从百分之几到百分之几十不等,要根据需要而定。其他各种天然培养基也可根据需 要加入 合成培养基的种类虽多,但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些 其它辅助性成分。 (1)氨基酸必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的,因此,在制备培养基时需加入必 需氨基酸,另外还需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于细胞系不同,对各种氨基酸的需要也不 同。有时也加入其他非必需氨基酸,氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度,其平衡可 影响细胞存活的生长速率。在细胞培养中,大多数细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源 (2)维生素 Eagle基本培养基中只含B族维生素,其他维生素都靠从血清中取得。血 清浓度降低时,对其他维生素的需求更加明显,但也有些情况,即使血清存在,它们也必不 可少。维生素限制可从细胞存活和生长速率看出,而不是以最大细胞密度为指标 (3)碳水化合物碳水化合物是细胞生命的能量来源,有的是合成蛋白质和核酸的成分 主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸钠等 (4)无机盐无机盐是细胞的重要组成部分之一,它们积极参与细胞的代谢活动。无机 盐中Na'、K'、Mg2、Ca2、CI、S02、P0和HCO0等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透 压的主要成分。对悬浮培养,要减少钙,可使细胞聚集和贴壁最少,碳酸氢钠浓度与气相 CO2浓度有关。 5)有机添加剂复杂培养基都含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类、氧化还 原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等及其他各种化合物。同样,当血清量减少时,必须添加这种化 合物,它们对克隆和维持这些特殊细胞有益。 (6)血清组织细胞培养中常用的天然培养基是血清。这是因为血清中含有大量的蛋白
核酸等，对动物细胞的生长繁殖具有促进作用。同时，血清对细胞贴壁和保护亦有明显作用， 且能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。 图 14-1 动物细胞形态 （a）成纤维细胞型；（b）上皮细胞型；（c）游走细胞型；（d）多形性细胞型 合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成。但这 种模拟不是被动和不加选择的，而是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的 人工合成培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基无法相比的优点。它给细胞提供了一 个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的体外生存环境。目前所有细胞培养室都己采用 经标准化生产、组份和含量都相对固定的各种合成培养基，如 Eagle 基本培养基和更复杂的 NCTC109，TC199，HEM，DME，RPMI1640，McCoy5A，HAMF12 等。尽管现代的合成培养基成份 和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要。在合成培养基中都或 多或少的要加入—定比例的灭然培养基加以补充。目前多采用胎牛血清、小牛血清、马血清 等，比例从百分之几到百分之几十不等，要根据需要而定。其他各种天然培养基也可根据需 要加入。 合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些 其它辅助性成分。 (1)氨基酸 必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必 需氨基酸，另外还需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于细胞系不同，对各种氨基酸的需要也不 同。有时也加入其他非必需氨基酸，氨基酸浓度常常限制可得到的最大细胞密度，其平衡可 影响细胞存活的生长速率。在细胞培养中，大多数细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源。 (2)维生素 Eagle 基本培养基中只含 B 族维生素，其他维生素都靠从血清中取得。血 清浓度降低时，对其他维生素的需求更加明显，但也有些情况，即使血清存在，它们也必不 可少。维生素限制可从细胞存活和生长速率看出，而不是以最大细胞密度为指标。 (3)碳水化合物 碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分， 主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸钠等。 (4)无机盐 无机盐是细胞的重要组成部分之一，它们积极参与细胞的代谢活动。无机 盐中 Na+、K +、Mg2+、Ca 2+、Cl -、SO4 2-、PO4 3-和 HCO3 -等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透 压的主要成分。对悬浮培养，要减少钙，可使细胞聚集和贴壁最少，碳酸氢钠浓度与气相 CO2 浓度有关。 (5)有机添加剂 复杂培养基都含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类、氧化还 原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等及其他各种化合物。同样，当血清量减少时，必须添加这种化 合物，它们对克隆和维持这些特殊细胞有益。 (6)血清 组织细胞培养中常用的天然培养基是血清。这是因为血清中含有大量的蛋白
质、核酸、激素等丰富的营养物质,对促进细胞生长繁殖,粘附及中和某些物质的毒性起着 定的作用。最常用的是小牛血清,胎牛血清。人血清用于一些人细胞系。大多数动物细胞 培养必须在培养基中添加血清,但在许多情况下,细胞可在无血清条件下维持和增殖。 目前合成培养基的配方都已相对固定,并形成配制好的干粉型商品。其成分趋于简单化, 以能维持细胞生长的最低需求,而去除了不必要的成份。同时为适应某些特殊培养的需要补 加一些新的成分,如培养杂交瘤细胞时采用DMEM培养基需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇:为 增加细胞转化和DNA合成,有时补加植物血凝素(PHA)等。这些变化需根据实验和细胞的具 体要求而定。 2、培养基制备以及制备过程中应考虑的因素 虽然各种培养基的组成各有不同、但形成商品化的干粉型培养基的配制方法却大同小 异。绝大多数合成培养基的生产都己标准化、商品化。较为常用的培养基市场上很容易购得 这种干粉型培养基性质稳定,便于储存、运输、价格便宜,给使用和配制合成培养基带来很 大方便。一般的特殊需求也多可在现有合成培养基基础上补加或调整某些成份予以满足。以 往实验室自购各个组份,称量后再按一定顺序进行溶解配制的老方法,一方面需购置大量各 种各样的成份,而且每种成份用量很少,很难控制和统一;另一方面要精确称量,顺序溶解, 步骤繁琐,质量难以保证。除了因特殊需要而专门配制一些特殊培养基外,大部分已不再使 用 在制备培养基时,通常要考虑以下因素: (1)p值多数细胞系在pH=7.4下生长得很好。尽管各细胞株之间细胞生长最佳p值 变化很小,但一些正常的成纤维细胞系以pH=7.4~7.7最好,转化细胞以pH=7.0~7.4更合 适。据报道,上皮细胞以p=5.5合适。为确定最佳pH值,最好做一个简单的生长实验或特 殊功能分析 酚红常用作指示剂,pH=7.4呈红色,pH=7.0变橙色,pH=6.5变黄色,而pH=7.6呈红 色中略带蓝色,p=7.8呈紫色。由于对颜色的观察有很大的主观性,因而必须用无菌平衡 盐溶液和同样浓度的酚红配一套标准样,放在与制备培养基相同的瓶子中 ()缓冲能力碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成本低、对培养物有营养作用,因此比其 他缓冲系统用得多。在生理p值条件下的缓冲能力差。 (3)渗透压多数培养细胞对渗透压有很宽的耐受范围,一般常用冰点降低或蒸汽压升 高测定。如果自己配培养基,可通过测定渗透压防止称量和稀释等造成的误差。 (4)粘度培养基的粘度主要受血清含量的影响,在多数情况下,对细胞生长没有什么 影响。在搅拌条件下,用羧甲基纤维素増加培养基的粘度,可减轻细胞损害。这对在低血清 浓度或无血清下条件下培养细胞显得尤为重要。 三、动物细胞培养方法和环境要求 (一)动物细胞培养的方法 动物细胞的体外培养有两种类型,一类是贴壁依赖性细胞,大多数动物细胞,包括非淋 巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞部属于这一类型。这一类需采用贴壁培养。另一类是 非贴壁依赖性细胞,来源于血液、淋巴组织的细胞,许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些 转化细胞属于这一类型。这一类可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。 所谓的贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷 的固体或半固体的表面上才能正常生长,并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是 先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法 分散成细胞悬液,经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中,再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察,适于实验室
质、核酸、激素等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖，粘附及中和某些物质的毒性起着 一定的作用。最常用的是小牛血清，胎牛血清。人血清用于一些人细胞系。大多数动物细胞 培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况下，细胞可在无血清条件下维持和增殖。 目前合成培养基的配方都已相对固定，并形成配制好的干粉型商品。其成分趋于简单化， 以能维持细胞生长的最低需求，而去除了不必要的成份。同时为适应某些特殊培养的需要补 加—些新的成分，如培养杂交瘤细胞时采用 DMEM 培养基需补加丙酮酸钠和 2-硫基乙醇；为 增加细胞转化和 DNA 合成，有时补加植物血凝素(PHA)等。这些变化需根据实验和细胞的具 体要求而定。 2、培养基制备以及制备过程中应考虑的因素 虽然各种培养基的组成各有不同、但形成商品化的干粉型培养基的配制方法却大同小 异。绝大多数合成培养基的生产都己标准化、商品化。较为常用的培养基市场上很容易购得。 这种干粉型培养基性质稳定，便于储存、运输、价格便宜，给使用和配制合成培养基带来很 大方便。一般的特殊需求也多可在现有合成培养基基础上补加或调整某些成份予以满足。以 往实验室自购各个组份，称量后再按一定顺序进行溶解配制的老方法，一方面需购置大量各 种各样的成份，而且每种成份用量很少，很难控制和统一；另一方面要精确称量，顺序溶解， 步骤繁琐，质量难以保证。除了因特殊需要而专门配制一些特殊培养基外，大部分已不再使 用。 在制备培养基时，通常要考虑以下因素： (1)pH 值 多数细胞系在 pH=7.4 下生长得很好。尽管各细胞株之间细胞生长最佳 pH 值 变化很小，但一些正常的成纤维细胞系以 pH=7.4～7.7 最好，转化细胞以 pH=7.0～7.4 更合 适。据报道，上皮细胞以 pH=5.5 合适。为确定最佳 pH 值，最好做一个简单的生长实验或特 殊功能分析。 酚红常用作指示剂，pH=7.4 呈红色，pH=7.0 变橙色，pH=6.5 变黄色，而 pH=7.6 呈红 色中略带蓝色，pH=7.8 呈紫色。由于对颜色的观察有很大的主观性，因而必须用无菌平衡 盐溶液和同样浓度的酚红配一套标准样，放在与制备培养基相同的瓶子中。 (2)缓冲能力 碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成本低、对培养物有营养作用，因此比其 他缓冲系统用得多。在生理 pH 值条件下的缓冲能力差。 (3)渗透压 多数培养细胞对渗透压有很宽的耐受范围，一般常用冰点降低或蒸汽压升 高测定。如果自己配培养基，可通过测定渗透压防止称量和稀释等造成的误差。 (4)粘度 培养基的粘度主要受血清含量的影响，在多数情况下，对细胞生长没有什么 影响。在搅拌条件下，用羧甲基纤维素增加培养基的粘度，可减轻细胞损害。这对在低血清 浓度或无血清下条件下培养细胞显得尤为重要。 三、动物细胞培养方法和环境要求 （一）动物细胞培养的方法 动物细胞的体外培养有两种类型，一类是贴壁依赖性细胞，大多数动物细胞，包括非淋 巴组织的细胞和许多异倍体体系的细胞部属于这一类型。这一类需采用贴壁培养。另一类是 非贴壁依赖性细胞，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞(包括杂交瘤细胞)和某些 转化细胞属于这一类型。这—类可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。 所谓的贴壁培养是指大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷 的固体或半固体的表面上才能正常生长，并最终在附着表面扩展成单层。其基本操作过程是： 先将采集到的活体动物组织在无菌条件下采用物理(机械分散法)或化学(酶消化法)的方法 分散成细胞悬液，经过滤、离心、纯化、漂洗后接种到加有适宜培养液的培养皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培养箱进行培养。用此法培养的细胞生长良好且易于观察，适于实验室
研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性,一旦细胞形成单层,生长就会受到抑制,细胞 产量有限。如要继续培养,还需将已形成单层的细胞再分散,稀释后重新接种,然后进行传 代培养。 而悬浮培养是指少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物,悬浮于培养液中 即可良好生长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物 组织经分散、过滤、纯化、漂洗后,按一定密度接种于适宜培养液中,置于特定的培养条件 下即可良好生长。传代时不需要再分散,只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快, 产量高,培养过程简单,是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的 细胞适于悬浮培养 从培养方式来看,动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养,均可采用分批式、分批补料 式、半连续式、连续式等多种培养方式。从培养系统来看,主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统,且以灌注式连续培养方式为佳。 1、分批式培养( Batch culture) 分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养,细胞不断生长,同时 产物也不断形成,经过一段时间的培养后,终止培养。在细胞分批培养过程中,不向培养系 统补加营养物质,而只向培养基中通入氧,能够控制的参数只有p值、温度和通气量。因 此细胞所处的生长环境随着营养物质的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化,不能 使细胞自始至终处于最优的条件下,因而分批培养并不是一种理想的培养方式。分批培养过 程特征如图14-2 pH值、温度、DO 条 件 营养物 时间 图14-2动物细胞分批式培养过程的特征 细胞分批式培养的生长曲线与微生物细胞的生长曲线基本相同。在分批式培养过程中, 可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段 分批培养过程中的延滞期是指细胞接种后到细胞分裂繁殖所需的时间,延滞期的长短根 据环境条件的不同而不同,并受原代细胞本身的条件影响。一般认为,细胞延滞期是细胞分 裂繁殖前的准备时期,一方面,在此时期内细胞不断适应新的环境条件,另一方面又不断积 累细胞分裂繁殖所必需的一些活性物质,并使之达到一定的浓度。因此,一般选用生长比较 旺盛的处于对数生长期的细胞作为种子细胞,以缩短延滞期。 细胞经过延滞期后便开始迅速繁殖,进入对数生长期,在此时期细胞随时间呈指数函数 形式增长,细胞的比生长速率为一定值,根据定义 =1.a (14-1) (14-2)
研究。但贴壁生长的细胞有接触抑制的特性，一旦细胞形成单层，生长就会受到抑制，细胞 产量有限。如要继续培养，还需将已形成单层的细胞再分散，稀释后重新接种，然后进行传 代培养。 而悬浮培养是指少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中 即可良好生长。悬浮生长的细胞其培养和传代都十分简便。培养时只需将采集到的活体动物 组织经分散、过滤、纯化、漂洗后，按一定密度接种于适宜培养液中，置于特定的培养条件 下即可良好生长。传代时不需要再分散，只需按比例稀释后即可继续培养。此法细胞增殖快， 产量高，培养过程简单，是大规模培养动物细胞的理想模式。但在动物体中只有少数种类的 细胞适于悬浮培养。 从培养方式来看，动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养，均可采用分批式、分批补料 式、半连续式、连续式等多种培养方式。从培养系统来看，主要采用中空纤维培养系统和微 载体系统，且以灌注式连续培养方式为佳。 1、分批式培养(Batch culture) 分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时 产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。在细胞分批培养过程中，不向培养系 统补加营养物质，而只向培养基中通入氧，能够控制的参数只有 pH 值、温度和通气量。因 此细胞所处的生长环境随着营养物质的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化，不能 使细胞自始至终处于最优的条件下，因而分批培养并不是一种理想的培养方式。分批培养过 程特征如图 14-2。 图 14-2 动物细胞分批式培养过程的特征 细胞分批式培养的生长曲线与微生物细胞的生长曲线基本相同。在分批式培养过程中， 可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。 分批培养过程中的延滞期是指细胞接种后到细胞分裂繁殖所需的时间，延滞期的长短根 据环境条件的不同而不同，并受原代细胞本身的条件影响。一般认为，细胞延滞期是细胞分 裂繁殖前的准备时期，一方面，在此时期内细胞不断适应新的环境条件，另一方面又不断积 累细胞分裂繁殖所必需的一些活性物质，并使之达到一定的浓度。因此，一般选用生长比较 旺盛的处于对数生长期的细胞作为种子细胞，以缩短延滞期。 细胞经过延滞期后便开始迅速繁殖，进入对数生长期，在此时期细胞随时间呈指数函数 形式增长，细胞的比生长速率为一定值，根据定义 dt dX X = 1 （14-1） 则 t X X e = 0 （14-2）