第十一章细胞周期及其调控第四节细胞周期调控一、研究背景Rao和Johnson(1970、1972、1974)将Hela细胞同步于不同阶段，然后与M期细胞混合，在灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与M期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟凝集染色体（prematurelycondensedchromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集（prematurechromosomecondensation)。G期PCC为单线状，因DNA未复制。S期PCC为粉末状，因DNA由多个部位开始复制。G2期PCC为双线染色体，说明DNA复制已完成。MiatotiM-phasS-phasG,chromosomeschromosomeschromosomescnromosomesnromosornosomet图11-15不同形态的PCC不仅同类M期细胞可以诱导PCC，不同类的M期细胞也可以诱导PCC产生，如人和蟾蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着M期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因子，即成熟促进因子(maturationpromotingfactor，MPF)。早在1960s，YoshioMasui发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂(GerminalVesicleBreakdown，GVBD)，后来Sunkara将不同时期Hela细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中，发现G和S期的抽取物不能诱导GVBD，而G2和M期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在CHO细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的MF。这类物质被统称为MPF。?1960sLelandHartwell以芽殖酵母（图11-16）为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(celldivisioncyclegene，CDC)。如芽殖酵母的cdc28基因，在G2/M转换点发挥重要的功能。Hartwell
第十一章 细胞周期及其调控 第四节 细胞周期调控 一、研究背景 Rao 和 Johnson(1970、1972、1974)将 Hela 细胞同步于不同阶段，然后与 M 期细胞混合，在 灭活仙台病毒介导下，诱导细胞融合，发现与 M 期细胞融合的间期细胞产生了形态各异的早熟 凝集染色体(prematurely condensed chromosome，PCC)，这种现象叫做早熟染色体凝集(premature chromosome condensation)。 G1 期 PCC 为单线状，因 DNA 未复制。 S 期 PCC 为粉末状，因 DNA 由多个部位开始复制。 G2 期 PCC 为双线染色体，说明 DNA 复制已完成。 图 11-15 不同形态的 PCC 不仅同类 M 期细胞可以诱导 PCC，不同类的 M 期细胞也可以诱导 PCC 产生，如人和蟾 蜍的细胞融合时同样有这种效果，这就意味着 M 期细胞具有某种促进间期细胞进行分裂的因 子，即成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)。 早在 1960s，Yoshio Masui 发现成熟蛙卵的提取物能促进未成熟卵的胚胞破裂(Germinal Vesicle Breakdown，GVBD)，后来 Sunkara 将不同时期 Hela 细胞的提取液注射到蛙卵母细胞中， 发现 G1 和 S 期的抽取物不能诱导 GVBD，而 G2 和 M 期的则具有促进胚胞破裂的功能，它将这 种诱导物质称为有丝分裂因子(MF)。后来在 CHO 细胞，酵母和粘菌中也提取出相同性质的 MF。 这类物质被统称为 MPF。 ?1960s Leland Hartwell 以芽殖酵母（图 11-16）为实验材料，利用阻断在不同细胞周期阶段 的温度敏感突变株（在适宜的温度下和野生型一样），分离出了几十个与细胞分裂有关的基因(cell division cycle gene，CDC)。如芽殖酵母的 cdc28 基因，在 G2/M 转换点发挥重要的功能。Hartwell
还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。ChromosomecondensationSpindlepoleSpindleformationbodyduplicatio福ChromosomesegregationDNANucleardivisionG1CytokinesisAGrowt!图11-16裂殖酵母细胞周期1970sPaulNurse等人以裂殖酵母（图11-17）为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2、cdc25的突变型和在限制的温度下无法分裂；wee1突变型则提早分裂，而cdc25和weel都发生突变的个体却会正常地分裂（图11-18）。进一步的研究发现cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。而weel和cdc25分别表现为抑制和促进CDC2的活性。这也解释了为何cdc25和Wee1双重突变的个体可以恢复野生型的表型。NuclearmigratiChromosomeOleardivisionDNAreplicatoSpindlepolebodyduplicationSTARTGrowth
还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了 checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指 当 DNA 受到损伤时，细胞周期会停下来。 图 11-16 裂殖酵母细胞周期 1970s Paul Nurse 等人以裂殖酵母（图 11-17）为实验材料，同样发现了许多细胞周期调控 基因，如：裂殖酵母 cdc2、cdc25 的突变型和在限制的温度下无法分裂；wee1 突变型则提早分 裂，而 cdc25 和 wee1 都发生突变的个体却会正常地分裂（图 11-18）。进一步的研究发现 cdc2 和 cdc28 都编码一个 34KD 的蛋白激酶，促进细胞周期的进行。而 weel 和 cdc25 分别表现为抑 制和促进 CDC2 的活性。这也解释了为何 cdc25 和 wee1 双重突变的个体可以恢复野生型的表 型
图11-17芽殖酵母细胞周期(a)DeficitofCdc25ExcessofWee1Elongated cells(lncreasedG2)ExcessofCdc25?DeficitofWee1Small cells(DecreasedG2)图11-18Cdc25表达不足，细胞长得过长而不分裂；Weel表达不足，细胞很小就开始分裂1983年TimothyHunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，Gz/M时达到高峰，M结束后突然消失，下轮间期又重新合成，故命名为周期蛋白(cyclin)。后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细胞周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。用海洋无脊椎动物和两栖类的卵为实验材料进行这类实验，好处在于卵的量比较大，而且在胚胎发育的早期，细胞分裂是同步化的。人，cyclincyclin-dependentkinase (Cdk)(B)(A)图11-19MPF=CDC2+CyclinB1988年M.J.Lohka纯化了爪蟾的MPF，经鉴定由32KD和45KD两种蛋白组成，二者结
图 11-17 芽殖酵母细胞周期 图 11-18 Cdc25 表达不足，细胞长得过长而不分裂；Wee1 表达不足，细胞很小就开始分裂 1983 年 Timothy Hunt 首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周 期剧烈振荡，在每一轮间期开始合成，G2/M 时达到高峰，M 结束后突然消失，下轮间期又重新 合成，故命名为周期蛋白(cyclin)。后来在青蛙、爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况， 各类动物来源的细胞周期蛋白 mRNA 均能诱导蛙卵的成熟。用海洋无脊椎动物和两栖类的卵为 实验材料进行这类实验，好处在于卵的量比较大，而且在胚胎发育的早期，细胞分裂是同步化的。 图 11-19 MPF=CDC2+Cyclin B 1988 年 M. J. Lohka 纯化了爪蟾的 MPF，经鉴定由 32KD 和 45KD 两种蛋白组成，二者结
合可使多种蛋白质磷酸化（图11-19）。后来PaulNurse（1990）进一步的实验证明P32实际上是CDC2的同源物，而P45是cyclinB的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。2001年10月8日美国人Leland?Hartwell、英国人PaulNurse、Timothy?Hunt因对细胞周期调控机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖（图11-20）。图11-202001年诺贝尔生理医学奖获得者（图片来自http://www.nobel.se/）二、CDKCDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependentkinase，CDK)，因此CDC2又被称为CDK1，激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将Hi磷酸化导致染色体的凝缩等等。这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此，CDK激酶和其调节因子又被称作细胞周期引擎。目前发现的CDK在动物中有7种。各种CDK分子均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。三、CKI细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDK?inhibitor，CKI）对细胞周期起负调控作用，目前发现的CKI分为两大家族：①Ink4(Inhibitorofcdk4)，如P16ink4a、P15ink4b、P18nk4c、P19inked，特异性抑制cdk4·cyclinD1、cdk6·cyclinDI复合物。②Kip(Kinase inhibition protein)：包括P21cipl(cyclin inhibition protein1)、P27kip'(kinaseinhibitionprotein1)、P57kip2等，能抑制大多数CDK的激酶活性，P21cipl还能与DNA聚合酶的辅助因子PCNA（proliferatingcellnuclearantigen）结合，直接抑制DNA的合成（图11-21）
合可使多种蛋白质磷酸化（图 11-19）。后来 Paul Nurse（1990）进一步的实验证明 P 32 实际上是 CDC2 的同源物，而 P 45 是 cyclinB 的同源物，从而将细胞周期三个领域的研究联系在一起。 2001 年 10 月 8 日美国人 Leland?Hartwell、英国人 Paul Nurse、Timothy?Hunt 因对细胞周期调控 机理的研究而荣获诺贝尔生理医学奖（图 11-20）。 图 11-20 2001 年诺贝尔生理医学奖获得者（图片来自 http://www.nobel.se/） 二、CDK CDC2 与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase，CDK)，因此 CDC2 又被称为 CDK1，激活的 CDK1 可将靶蛋白磷酸化而产生 相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将 H1 磷酸化导致染色体 的凝缩等等。这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此，CDK 激酶和其调节因子又被 称作细胞周期引擎。 目前发现的 CDK 在动物中有 7 种。各种 CDK 分子均含有一段相似的激酶结构域，这一区 域有一段保守序列，即 PSTAIRE，与周期蛋白的结合有关。 三、CKI 细胞中还具有细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDK?inhibitor，CKI）对细胞周期起负调 控作用，目前发现的 CKI 分为两大家族： ①Ink4(Inhibitor of cdk 4)，如 P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d，特异性抑制 cdk4·cyclin D1、cdk6·cyclin D1 复合物。 ②Kip(Kinase inhibition protein)：包括 P21cip1 (cyclin inhibition protein 1)、P27kip1(kinase inhibition protein 1)、P57kip2 等，能抑制大多数 CDK 的激酶活性，P21cip1 还能与 DNA 聚合酶 δ 的 辅助因子 PCNA（proliferating cell nuclear antigen）结合，直接抑制 DNA 的合成（图 11-21）
xDNA damageIncreaseinlevelofp53XYp21mRNAp21Cdk'sPCNAInhibition ofInhibition ofcellcycleDNA replication图11-21P21cip1抑制CDK和PCNA四、Cyclin周期蛋白不仅仅起激活CDK的作用，还决定了CDK何时、何处、将何种底物磷酸化，从而推动细胞周期的前进。目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有30余种，在脊椎动物中为A1-2、B1-3、C、D1-3、E1-2、F、G、H等。分为G型、Gi/S型S型和M型4类（见表11-1）。各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导周期蛋白与CDK结合。表11-1不同类型的周期蛋白脊椎动物芽殖酵母激酶复合体CDKCyclinCyclinCDKGi-CDKCyclin D*CDK4、6Cln 3CDK1(CDC28)Gr/S-CDKCyclin ECDK2Cln 1、2CDK1(CDC28)CDK2S-CDKCyclin AClb 5、6CDK1(CDC28)M-CDKCyclin BCDK1(CDC2)Clb 1-4CDK1(CDC28)
图 11-21 P21cip1 抑制 CDK 和 PCNA 四、Cyclin 周期蛋白不仅仅起激活 CDK 的作用，还决定了 CDK 何时、何处、将何种底物磷酸化，从 而推动细胞周期的前进。目前从芽殖酵母、裂殖酵母和各类动物中分离出的周期蛋白有 30 余种， 在脊椎动物中为 A1-2、B1-3 、C、 D1-3、E1-2、F、G、H 等。分为 G1 型、G1/S 型 S 型和 M 型 4 类（见表 11-1）。各类周期蛋白均含有一段约 100 个氨基酸的保守序列，称为周期蛋白框，介导 周期蛋白与 CDK 结合。 表 11-1 不同类型的周期蛋白 激酶复合体 脊椎动物 芽殖酵母 Cyclin CDK Cyclin CDK G1-CDK Cyclin D* CDK4 、6 Cln 3 CDK1(CDC28) G1/S-CDK Cyclin E CDK2 Cln 1、2 CDK1(CDC28) S-CDK Cyclin A CDK2 Clb 5、6 CDK1(CDC28) M-CDK Cyclin B CDK1(CDC2) Clb 1-4 CDK1(CDC28)