第三章蛋白质 第节 蛋白质论 蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子,几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果,因此, 蛋白质是现代生物技术,尤其是基因工程,蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。 蛋白质的化学组成与分类 l、元素组成 碳50%氢。氧23%氮16%硫0-3%微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮:平均含氮16%,粗蛋白质含量=蛋白氮×625 2、氨基酸组成 从化学结构上看,蛋白质是由20种L型a氨基酸组成的长链分子。 3、分类 (1)、按组成: 简单蛋白:完全由氨基酸组成 结合蛋白:除蛋白外还有非蛋白成分(辅基) 详细分类,P75表3-1,表3-2。(注意辅基的组成)。 (2)、按分子外形的对称程度 球状蛋白质:分子对称,外形接近球状,溶解度好,能结晶,大多数蛋白质属此类。 纤维状蛋白质:对称性差,分子类似细棒或纤维状。 (3)、功能分 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。 4、蛋白质在生物体内的分布 含量干重)微生物50-80% 人体45% 一般细胞50% 种类大肠杆菌3000种 人体10万种 生物界10 蛋白质分子大小与分子量 蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物,a数目由几个到成百上千个,分子量从几千到几千万。一般情况下,少于50
１ 第三章 蛋白质 第一节 蛋白质概论 蛋白质是所有生物中非常重要的结构分子和功能分子，几乎所有的生命现象和生物功能都是蛋白质作用的结果，因此， 蛋白质是现代生物技术，尤其是基因工程，蛋白质工程、酶工程等研究的重点和归宿点。 一、 蛋白质的化学组成与分类 1、元素组成 碳 50% 氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0-3% 微量的磷、铁、铜、碘、锌、钼 凯氏定氮：平均含氮16%，粗蛋白质含量=蛋白氮×6.25 2、氨基酸组成 从化学结构上看，蛋白质是由20 种L-型α氨基酸组成的长链分子。 3、分类 （1）、 按组成： 简单蛋白：完全由氨基酸组成 结合蛋白：除蛋白外还有非蛋白成分（辅基） 详细分类，P 75 表 3-1，表 3-2。（注意辅基的组成）。 （2）、 按分子外形的对称程度： 球状蛋白质：分子对称，外形接近球状，溶解度好，能结晶，大多数蛋白质属此类。 纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维状。 （3）、 功能分： 酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白。 4、蛋白质在生物体内的分布 含量(干重) 微生物 50-80% 人 体 45% 一般细胞 50% 种类 大肠杆菌 3000 种 人体 10 万种 生物界 1010 -1012 二、 蛋白质分子大小与分子量 蛋白质是由20种基本aa组成的多聚物，aa数目由几个到成百上千个，分子量从几千到几千万。一般情况下，少于50
个a的低分子量a多聚物称为肽,寡肽或生物活性肽,有时也罕称多肽。多于50个a的称为蛋白质。但有时也把含有 条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时,多肽一词着重于结构意义,而蛋白质原则强调了其功能意义。 P76表3-3(注意:单体蛋白、寡聚蛋白;残基数、肽链数。) 蛋白质分子量=aa数目*110 对于任一给定的蛋白质,它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的,均一性。 、蛋白质分子的构象与结构层次 蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链,每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构,这种空间结构称为 蛋白质的(天然)构象 P77图3-1,蛋白质分子的构象示意图 一级结构氨基酸顺序 二级结构α螺旋、β折叠、β转角,无规 三级结构α螺旋、β折叠、β转角、松散 四级结构多亚基聚集 四、蛋白质功能的多样性 细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子 1.酶 2.结构成分(结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白) 3.贮藏(卵清蛋白、种子蛋白) 4.物质运输(血红蛋白、Na-K- ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体) 5.细胞运动(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白) 6.激素功能(胰岛素) 7.防御(抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白) 8.接受、传递信息(受体蛋白,味觉蛋白) 9.调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达(组蛋白、阻遏蛋白) 第二节 氨基酸 蛋白质的水解见P79 氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下,可以被水解成氨基酸单体。 酸水解:色氨酸破坏,天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解:消旋,色氨酸稳定 酶水解:水解位点特异,用于级结构分析,肽谱氨基酸的功能: (1)、组成蛋白质 (2)、一些aa及其衍生物充当化学信号分子 y-amino butyric acid(氨基丁酸、 Serotonin(5羟色胺,血清紧张素)、 melaton(褪黑激素,N乙酰甲氧基色胺),都是
２ 个 aa的低分子量aa多聚物称为肽，寡肽或生物活性肽，有时也罕称多肽。多于50个aa的称为蛋白质。但有时也把含有一 条肽链的蛋白质不严谨地称为多肽。此时，多肽一词着重于结构意义，而蛋白质原则强调了其功能意义。 P 76 表 3-3 （注意：单体蛋白、寡聚蛋白；残基数、肽链数。） 蛋白质分子量= aa数目*110 对于任一给定的蛋白质，它的所有分子在氨基酸组成、顺序、肽链长度、分子量等方面都是相同的，均一性。 三、 蛋白质分子的构象与结构层次 蛋白质分子是由氨基酸首尾连接而成的共价多肽链，每一种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构称为 蛋白质的（天然）构象。 P77 图 3-1，蛋白质分子的构象示意图。 一级结构 氨基酸顺序 二级结构 α螺旋、β折叠、β转角，无规卷曲 三级结构 α螺旋、β折叠、β转角、松散肽段 四级结构 多亚基聚集 四、 蛋白质功能的多样性 细胞中含量最丰实、功能最多的生物大分子。 1． 酶 2． 结构成分（结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性蛋白、膜蛋白） 3． 贮藏（卵清蛋白、种子蛋白） 4． 物质运输（血红蛋白、Na+ -K+ -ATPase、葡萄糖运输载体、脂蛋白、电子传递体） 5． 细胞运动（肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白） 6． 激素功能（胰岛素） 7． 防御（抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白） 8． 接受、传递信息（受体蛋白，味觉蛋白） 9． 调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达（组蛋白、阻遏蛋白） 第二节 氨基酸 一、 蛋白质的水解(见P79) 氨基酸是蛋白质的基本结构单位。在酸、碱、蛋白酶的作用下，可以被水解成氨基酸单体。 酸水解：色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基 碱水解：消旋，色氨酸稳定 酶水解：水解位点特异，用于一级结构分析，肽谱氨基酸的功能： （1）、 组成蛋白质 （2）、 一些 aa及其衍生物充当化学信号分子 -amino butyric acid (-氨基丁酸)、Serotonic(5-羟色胺，血清紧张素)、melatonin(褪黑激素，N-乙酰-甲氧基色胺)，都是
神经递质,后二者是色氨酸衍生物神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细孢功能的物质)。 Thyroxine(甲状腺素,动物甲状腺 thyroid gland产生的Tr衍生物和吲乙酸(植物中的Tp衍生物都是激素激素就是一 个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。 (3)、氨基酸是许多含N分子的前体物 核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都霈要a 些基本基酸和非基本a是代谢中闻物 精氨酸、iu山in(瓜氨酸)、 Omithine(鸟氨酸)是尿素循不( Urea cycle的中间物,含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是」 排除它们的一种重要机制。 氨基酸的结构与分类 l809年发现Asp,1938年发Th,目前己发现180多种。但是组成蛋白质的aa常见的有20种,称为基本氨基酸(编 码的蛋白质氨基酸),还有一些称为稀有氨基酸,是多肽合成后由基本a经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不 组成蛋白质的非蛋白质氨基酸约150种 编码的蛋白质氨基酸(20种) 也称基本氨基酸或标准氨基酸,有对应的遗传密码。 近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸,有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码,可能是第21种蛋白 质氨基酸。 结构通式 不变部分,可变部分。L型,羧酸的α-碳上接NH,所以都是L-α-氨基酸。 a-氨基酸都是白色晶体,熔点一般在200℃以上 除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水,脯氨酸和羟脯氨酸丕能溶于乙醇和乙醚。 表20种氨基酸结构 l、按照R基的化学结构分(蛋白质工程的同源替代) (1)、R为脂肪烃基的氨基酸(5种 Gly、Aa、Val、Leu、lle 图3-2 R基均为中性烷基(G↓为H),R基对分子酸碱性影响很小,它们几乎有相同的等电点。(60±003) P92表3-7(比较等电点。) Gly是唯一不含手性碳原子的氨基酸,因此不具旋光性 从G至le,R基团疏水性增加,le是这20种aa中脂溶性最强的之一(除Phe25、Tp34、Tr23以外)
３ 神经递质，后二者是色氨酸衍生物(神经递质是一个神经细胞产生的影响第二个神经细胞或肌肉细胞功能的物质)。 Thyroxine(甲状腺素，动物甲状腺thyroid gland产生的 Tyr 衍生物)和吲乙酸(植物中的Trp衍生物)都是激素(激素就是一 个细胞产生的调节其它细胞的功能的化学信号分子)。 （3）、 氨基酸是许多含N分子的前体物 核苷酸和核酸的含氮碱基、血红素、叶绿素的合成都需要aa （4）、 一些基本氨基酸和非基本aa是代谢中间物 精氨酸、Citrulline(瓜氨酸)、Ornithine(鸟氨酸)是尿素循不(Urea cycle)的中间物，含氮废物在脊椎动物肝脏中合成尿素是 排除它们的一种重要机制。 三、 氨基酸的结构与分类 1809 年发现 Asp，1938 年发 Thr，目前已发现 180 多种。但是组成蛋白质的 aa 常见的有 20 种，称为基本氨基酸（编 码的蛋白质氨基酸），还有一些称为稀有氨基酸，是多肽合成后由基本 aa 经酶促修饰而来。此外还有存在于生物体内但不 组成蛋白质的非蛋白质氨基酸(约150 种)。 （一） 编码的蛋白质氨基酸（20种） 也称基本氨基酸或标准氨基酸，有对应的遗传密码。 近年发现谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码UGA编码，可能是第21种蛋白 质氨基酸。 结构通式： 不变部分，可变部分。L-型，羧酸的α-碳上接-NH2，，所以都是L-α-氨基酸。 α-氨基酸都是白色晶体，熔点一般在200℃以上。 除胱氨酸和酪氨酸外都能溶于水，脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇和乙醚。 表 20 种氨基酸结构 1、按照 R基的化学结构分（蛋白质工程的同源替代）： （1）、 R 为脂肪烃基的氨基酸（5种） Gly、Ala、Val、Leu、Ile、 图 3-2 R 基均为中性烷基（Gly 为H），R 基对分子酸碱性影响很小，它们几乎有相同的等电点。（6 .0±0.03） P 92 表 3-7 （比较等电点。） Gly 是唯一不含手性碳原子的氨基酸，因此不具旋光性。 从 Gly 至Ile，R 基团疏水性增加，Ile 是这 20 种 a.a 中脂溶性最强的之一（除Phe 2.5、Trp3.4 、Tyr 2.3 以外）
(2) R中含有羟基和碗的基酸(共4种) 含羟基的有两种:Sc和Thr 图3-3 Sr的〔HOH基(pK=15),在生理条件下不解离,但它是一个极性基团,能与其它基团形成氢键,具有重要的生理 意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser残基存在。 Ihr中的-OH是仲醇,具有亲水性,但此OH形成氢键的能力较弱,因此,在蛋白质活性中心中很少出现 Ser和Thr的OH往往与糖链相连,形成糖蛋白。 含硫的两种:Cys、Met 图3 Cys中R含巯基(SH),Cys具有两个重要性质 (1)在较高pH值条件,巯基离解。 (2)两个Cys的巯基氧化生成二硫键,生成胱氨酸。 Cys-s Cys 二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。 Cys还常常出现在酶的活性中心。 Met的R中含有甲硫基(-SCH3),硫原子有亲核性,易发生极化,因此,Me是一种重要的甲基供体。 ◆Cys与结石 在细胞外液如血液中,Cys以胱氨酸 Cystine)氧化形式存在,胱氨酸的溶解性最差 胱氨酸尿( stenura)是一种遗传病,由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在腎( Kidney)、 输尿管( ureter、膀胱( urinary bladder)中结晶形成结石( Calculus. calculi),结石会导致疼疼、发炎甚至尿血 大量服用青霉胺rPeη nicillcemine)能降低肾中咣胱氨的含量,因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。 青霉胺的结构 (3)、R中含有酰胺基团(2种) Asn、Gln 图3-5 酰胺基中氨基易发生氨基转移反应,转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义 (4)、R中含有酸性基团(2种) Asp、Gu,般称酸性氨基酸 图3-6 Asp侧链羧基pKa(B-COOH)为386,Gu侧链羧基pKa(Y-COOH)为425 它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸 (5)、R中含碱性基团(3种) Lys、Arg、Hs,一般称碱性氨基酸 图3-7 Lys的R侧链上含有一个氨基,侧链氨基的pka为10.53。生理条件下,Iys侧链带有一个正电荷(-NH+),同时它 的侧链有4个C的直链,柔性较大,使侧链的氨基反应活性增大。(如肽聚糖的短肽间的连接) Arg是碱性最强的氨基酸,侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱,pKa值为1248,生理条件下完全质子化。 Hi含咪唑环,咪唑琍的p在游离氨基酸中和在多肽链中不同,前者pa为600,后者为735,它是20种氨基酸中 侧链pKa值最接近生理pH值的一种,在接近中性pH时,可离解平衡。它是在生理pl条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸 His含咪唑环,一侧去质子化和另一侧质子化同步进行,因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。 (6)、R中含有芳基的氨基酸(3种)
４ （2）、 R 中含有羟基和硫的氨基酸（共4种） 含羟基的有两种：Ser 和Thr。 图 3-3 Ser 的-CH2 OH基（pKa=15），在生理条件下不解离，但它是一个极性基团，能与其它基团形成氢键，具有重要的生理 意义。在大多数酶的活性中心都发现有Ser 残基存在。 Thr 中的-OH是仲醇，具有亲水性，但此-OH形成氢键的能力较弱，因此，在蛋白质活性中心中很少出现。 Ser 和 Thr 的-OH 往往与糖链相连，形成糖蛋白。 含硫的两种：Cys、Met 图 3-4 Cys 中 R 含巯基（-SH），Cys 具有两个重要性质： （1）在较高pH值条件，巯基离解。 （2）两个Cys 的巯基氧化生成二硫键，生成胱氨酸。 Cys—s—s—Cys 二硫键在蛋白质的结构中具有重要意义。 Cys 还常常出现在酶的活性中心。 Met 的 R 中含有甲硫基（-SCH3），硫原子有亲核性，易发生极化，因此，Met是一种重要的甲基供体。 ◆ Cys 与结石 在细胞外液如血液中，Cys 以胱氨酸(Cystine)氧化形式存在，胱氨酸的溶解性最差。 胱氨酸尿(Cystinuria)是一种遗传病，由于胱氨酸的跨膜运输缺陷导致大量的胱氨酸排泄到尿中。胱氨酸在肾(Kidney)、 输尿管(ureter)、膀胱(urinary bladder)中结晶形成结石(Calculus, calculi)，结石会导致疼疼、发炎甚至尿血。 大量服用青霉胺(Penicillcemine)能降低肾中胱氨的含量，因为青霉胺与半胱氨酸形成的化合物比胱氨酸易溶解。 青霉胺的结构 （3）、 R 中含有酰胺基团（2种） Asn、Gln 图 3-5 酰胺基中氨基易发生氨基转移反应，转氨基反应在生物合成和代谢中有重要意义 （4）、 R 中含有酸性基团（2种） Asp、Glu，一般称酸性氨基酸 图 3-6 Asp 侧链羧基pKa（β-COOH）为3.86，Glu 侧链羧基pKa（γ-COOH）为4.25 它们是在生理条件下带有负电荷的仅有的两个氨基酸。 （5）、 R 中含碱性基团（3种） Lys、Arg、His，一般称碱性氨基酸 图 3-7 Lys 的 R侧链上含有一个氨基，侧链氨基的pKa为10.53。生理条件下，Lys侧链带有一个正电荷（—NH3 +），同时它 的侧链有4 个C 的直链，柔性较大，使侧链的氨基反应活性增大。（如肽聚糖的短肽间的连接） Arg 是碱性最强的氨基酸，侧链上的胍基是已知碱性最强的有机碱，pKa 值为12.48，生理条件下完全质子化。 His 含咪唑环，咪唑环的 pKa在游离氨基酸中和在多肽链中不同，前者 pKa为 6.00，后者为 7.35，它是 20 种氨基酸中 侧链pKa值最接近生理pH值的一种，在接近中性pH时，可离解平衡。它是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。 His 含咪唑环，一侧去质子化和另一侧质子化同步进行，因而在酶的酸碱催化机制中起重要作用。 （6）、 R 中含有芳基的氨基酸（3种）
Phe、Try、Ti 图3-8 都具有共轭π电子体系易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge- transfer complex或电子重叠 复合物。在受体一底物、或分子相互识别过程中具有重要作用 这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰,蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸,在280m处,Tp>Ir>Phe Phe疏水性最强。 酪氨酸的OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制,τyr在较高pH值时,酚羟基离解 Trp有复杂的π共轭休系,比Phe和Tyr更易形城电荷转移络合物 (7)、R为环状的氨基酸(1种) Pro,有时也把Hs、Tp归入此类。 图3-9 Pro是唯一的一种环状结构的氨基酸,它的α-亚氨基是环的一部分,因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构 中具有极重要的作用,一般出现在两段α螺旋之间的转角处,Po残基所在的位置必然发生骨架方向的变化, ◆必需氨基酸: 成年人:Leu、le、Ⅷ、Thr、Mt、Tm、Lys、Ph 婴儿期:Arg和Hls供给不足,属半必须氨基酸 必须氨基酸在人体内不能合成,是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架(α酮酸) 2、按照R基的极性性质能否与水形成氢键20种基本a,可以分为4类 侧链极性(疏水性程度) Gu-25 Ala 05 Asn -2.5 Arg-3.0 M 1.3 His.5 Pro Thr 0.4 Leu 1.8 2.3 phe (1 非极性安基酸 9种,包括:甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸,这类氨基酸 的R基都是疏水性的,在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用 不带电何的极性氨基酸 6种,丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键,因此很容 易溶于水。 酪氨酸的OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制,Ser和Thr的OH往往与糖链相连,Asn和Gn的-NH2很容易形城成 氢键,因此能增加蛋白质的稳定性 (3)、带负电荷的a酸性a) 2种,在pH6-7时,谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离,因此,带负电何
５ Phe、Try、Trp 图 3-8 都具有共轭π电子体系,易与其它缺电子体系或π电子体系形成电荷转移复合物( charge-transfer complex)或电子重叠 复合物。在受体—底物、或分子相互识别过程中具有重要作用。 这三种氨基酸在紫外区有特殊吸收峰，蛋白质的紫外吸收主要来自这三种氨基酸，在280nm 处，Trp＞Tyr＞Phe。 Phe 疏水性最强.。 酪氨酸的-OH磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Tyr 在较高pH值时，酚羟基离解。 Trp 有复杂的π共轭休系，比Phe和Tyr 更易形成电荷转移络合物。 （7）、 R 为环状的氨基酸（1种） Pro，有时也把His、Trp归入此类。 图 3-9 Pro 是唯一的一种环状结构的氨基酸，它的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构。它在蛋白质空间结构 中具有极重要的作用，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化， ◆ 必需氨基酸： 成年人：Leu、Ile、Val、Thr、Met、Trp、Lys、Phe 婴儿期：Arg 和His 供给不足，属半必须氨基酸。 必须氨基酸在人体内不能合成，是由于人体内不能合成这些氨基酸的碳架（α-酮酸） 2、按照 R基的极性性质(能否与水形成氢键)20种基本aa，可以分为4类： 侧链极性(疏水性程度) Gly 0 Ser -0.3 Glu -2.5 Lys -3.0 Ala 0.5 Asn -0.2 Asp -2.5 Arg -3.0 Met 1.3 Gln -0.2 His 0.5 Pro 1.4 Thr 0.4 Val 1.5 Cys 1.0 Leu 1.8 Tyr 2.3 Ile 1.8 Phe 2.5 Trp 3.4 （1）、 非极性氨基酸 9 种，包括：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸氨酸、脯氨酸，这类氨基酸 的 R 基都是疏水性的，在维持蛋白质的三维结构中起着重要作用。 （2）、 不带电何的极性氨基酸 6 种，丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。这类氨基酸的侧链都能与水形成氢键，因此很容 易溶于水。 酪氨酸的-OH 磷酸化是一个十分普遍的调控机制，Ser 和 Thr 的-OH 往往与糖链相连，Asn 和 Gln 的-NH2很容易形成 氢键，因此能增加蛋白质的稳定性。 （3）、 带负电荷的aa(酸性aa) 2 种，在pH6~7 时，谷氨酸和天冬氨酸的第二个羧基解离，因此，带负电何