(4)、带正电何的aa(碱性aa) 3种,Amg、Lys、Hs在pH7时带净正电荷。 当胶原蛋白中的Iys侧链氧化时能形成很强的分子间内)交联。Arg的胚基碱性很强,与№aOH相当。His是一个弱碱, 在pH7时约10%质子化,是天然的缓冲剂,它往往存在于许多酶的活性中心。 酶的活性中心:Hi、Ser、Cs 非极性a一般位于蛋白质的硫琉水核心,带电荷的a和极性a位于表面。 非编码的白质氨基 也称修饰氨基酸,是在蛋白质合成后,由基本氨基酸修饰而来。 thrombin(凝血酶原中含有γ羧基谷氨酸,能结合Ca2 结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。 图3-10修饰a的结构 (1)4羟脯氨酸 (2)5羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白(如胶原蛋白)中。 (3)6N-甲基赖氨酸(存在于肌球蛋白中) (4)r-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca离子功能的蛋白质中。 (5)Iyr的衍生物:3.5·碘酪氨酸、甲状腺素(甲状腺蛋白中) (6)锁链素由4个Lys组成(弹性蛋白中) 非蛋白质氨基酸 除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外,生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物,它们不是蛋白质的结构单元,但在 生物体内具有很多生物学功能,如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸 (1)L型α-氨基酸的衍生物 L瓜氨酸 图 图 (2)D型氨基酸 D-Glu、DAla(肽聚糖中)、DPhe(短杆菌肽S) (3)β-、 氨基酸 β-Ala(泛素的前体)γ氨基丁酸(裨经递质)。 四、氨基酸的构型、旋光性和光吸收 l、氨基酸的构型 除(y外,19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子,因此有两种光学异构体,而Th和le的β-碳原子也是不对称 的,因此Thr、le各有两个不对称碳原子,有四种光学异构体
６ （4）、 带正电何的aa(碱性aa) 3 种，Arg、Lys、His。在pH7 时带净正电荷。 当胶原蛋白中的Lys侧链氧化时能形成很强的分子间(内)交联。Arg的胚基碱性很强，与NaOH相当。His是一个弱碱， 在 pH7 时约10%质子化，是天然的缓冲剂，它往往存在于许多酶的活性中心。 酶的活性中心：His、Ser、Cys 非极性 aa 一般位于蛋白质的疏水核心，带电荷的aa 和极性aa 位于表面。 （二） 非编码的蛋白质氨基酸 也称修饰氨基酸，是在蛋白质合成后，由基本氨基酸修饰而来。 Prothrombin(凝血酶原)中含有-羧基谷氨酸，能结合Ca2+。 结缔组织中最丰富的蛋白质胶原蛋白含有大量4-羟脯氨酸和5-羟赖氨酸。 图 3-10 修饰 aa 的结构 （1）4-羟脯氨酸 （2）5-羟赖氨酸 这两种氨基酸主要存在于结缔组织的纤维状蛋白（如胶原蛋白）中。 （3）6-N-甲基赖氨酸（存在于肌球蛋白中） (4)г-羧基谷氨酸 存在于凝血酶原及某些具有结合Ca 2+离子功能的蛋白质中。 （5）Tyr的衍生物： 3.5 -二碘酪氨酸、甲状腺素 （甲状腺蛋白中） （6）锁链素由4 个Lys组成（弹性蛋白中）。 （三） 非蛋白质氨基酸 除参与蛋白质组成的20多种氨基酸外，生物体内存在大量的氨基酸中间代谢产物，它们不是蛋白质的结构单元，但在 生物体内具有很多生物学功能，如尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。 （1）L-型α –氨基酸的衍生物 L-瓜氨酸 图 L-鸟氨酸 图 （2）D-型氨基酸 D-Glu、D-Ala（肽聚糖中）、D-Phe（短杆菌肽S） （3）β-、γ-、δ-氨基酸 β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。 四、 氨基酸的构型、旋光性和光吸收 1、氨基酸的构型 除 Gly外，19种氨基酸的α-碳原子都是不对称碳原子，因此有两种光学异构体，而Thr 和Ile的β-碳原子也是不对称 的，因此Thr、Ile 各有两个不对称碳原子，有四种光学异构体
图P86L苏氨酸D-苏氨酸L别一苏D-别-苏 构成蛋白质的氨基酸均属L型(L-苏氨酸),大部分游离氨基酸也是L型。 2、旋光性 20种氨基酸中,只有Gy无手性碳。Thr、le各有两个手性碳。其余17种氨基酸L型与D型互为镜象关系,互称 光学异构体(对映体,或立体异构体)。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转(记为(一)。另一个异构体可使偏振光 顺时针旋转(计为(+),称为旋光性。 光学异构体的其它理化性质完全相同。 外消旋物D型和L-型的等摩尔混合物 L-苏氨酸和D苏氨酸、L别一苏氨酸和D别苏氨酸分别组成消旋物,而L(D)苏氨酸和L(D)别一苏氨酸则是 非对映体 旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合 成氨基酸时也会得到无旋光性的D、L-消旋物 内消旋物分子内消旋 胱氨酸有三种立体异构体:L-胱氨酸、D胱氨酸、内消旋胱氨酸。 L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物 P86 L-胱氨酸 D-胱氨酸内消旋胱氨酸:(分子内部互相抵消而无旋光性) 蛋白质中L型基酸的比旋)度 P87蛋白质中L型氨基酸的比旋光度 氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基的性质,并与溶液的PH值有关(PH值影响氨基和羧基的解离)。 3、氨基酸的光吸收性 220种氨基酸在可见光区域无光吸收,在远紫外区(20m0均有光吸收,在近紫外区(2030m)只有下r、Ph 有吸收 Iyr、Phe、Tp的R基含有共轭双键,在220-300m紫外区有吸收 275 14×103 Phe 257 2.0×10 280 56×10 Lambert-Beer A=-g=l=E.c·L 五、氨基酸的酸碱性质(重点) l、氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性高子形式存在 α-氨基酸都含有-OOH和N,都是不挥发的结晶固体,熔点200350℃,不溶于非极性溶剂,而易溶于水,这些 性质与典型的羧酸( R-COOH)或胺(RNH)明显不同。 三个现象: ①晶体溶点高→离子晶格,不是分子晶格。 ②不溶于非极性溶剂→极性分子 ③介电常数高(氨基酸使水的介电常数增高,而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。)→水溶液中的氨基酸是极性分子 7
７ 图 P86 L-苏氨酸 D-苏氨酸 L-别一苏 D-别-苏 构成蛋白质的氨基酸均属L-型（L-苏氨酸），大部分游离氨基酸也是L-型。 2、旋光性 20 种氨基酸中，只有 Gly 无手性碳。Thr、Ile 各有两个手性碳。其余 17 种氨基酸的 L 型与 D 型互为镜象关系，互称 光学异构体（对映体，或立体异构体）。一个异构体的溶液可使偏振光逆时针旋转（记为（一））。另一个异构体可使偏振光 顺时针旋转（计为（+）），称为旋光性。 光学异构体的其它理化性质完全相同。 外消旋物：D-型和L-型的等摩尔混合物。 L-苏氨酸和D-苏氨酸、L-别一苏氨酸和D-别-苏氨酸分别组成消旋物，而L-（D-）苏氨酸和L-（D-）别一苏氨酸则是 非对映体。 旋光性物质在化学反应时经过对称的过度态时会发生消旋现象。蛋白质在与碱共热水解时或用一般的化学方法人工合 成氨基酸时也会得到无旋光性的D-、L-消旋物。。 内消旋物：分子内消旋 胱氨酸有三种立体异构体：L-胱氨酸、D-胱氨酸、内消旋胱氨酸。 L-胱氨酸和D-胱氨酸是外消旋物 图 P86 L-胱氨酸 D-胱氨酸 内消旋胱氨酸：（分子内部互相抵消而无旋光性） 蛋白质中L型氨基酸的比旋光度 P 87 蛋白质中L 型氨基酸的比旋光度。 氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R 基的性质，并与溶液的PH 值有关（PH 值影响氨基和羧基的解离）。 3、氨基酸的光吸收性 20种氨基酸在可见光区域无光吸收，在远紫外区（〈220nm〉均有光吸收，在近紫外区（220-300nm）只有 Tyr、Phe、 Trp 有吸收。 Tyr、Phe、Trp的R 基含有共轭双键，在220-300nm 紫外区有吸收。 λ（nm） ε Tyr 275 1.4×103 Phe 257 2.0×102 Trp 280 5.6×103 Lambert-Beer： 五、 氨基酸的酸碱性质（重点） 1、氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 α-氨基酸都含有-COOH 和-NH2，都是不挥发的结晶固体，熔点 200-350℃，不溶于非极性溶剂，而易溶于水，这些 性质与典型的羧酸（R-COOH）或胺（R-NH2）明显不同。 三个现象： ①晶体溶点高→离子晶格，不是分子晶格。 ②不溶于非极性溶剂→极性分子 ③介电常数高（氨基酸使水的介电常数增高，而乙醇、丙酮使水的介电常数降低。）→水溶液中的氨基酸是极性分子。 = − = = c L T I I I A lg lg . 0
原因:a-羧基pK1在20左右,当pl3.5,a-羧基以OOO形式存在。a氨基pkK2在94左右,当pH80时,a氨 基以aNH3形式存在。在pHB5-80时,带有相反电荷,因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在 Gily溶点232℃比相应的乙酸(165℃)、乙胺(-805℃)高,可推测氨基酸在晶体状态也是以两性离子形式存在 2、氨基酸的两性解高和酸碱滴定曲线 HA A+H pH= pKa+Logl轭碱]/供共轭酸 pOH=pKb+log共轭酸/[共轭喊 (1)pH>pK时,{>[酸 pH=pK时,[碱]=[酸 pK时,[酯 (2)κK就是=酸时溶液的pH值,K就是此时溶液的 (3)当碱=[酸时,溶液的pH值等于κK (4)Gy的两性解离和滴定曲线 图3-14Gly的滴定曲线 在pH234和pH960处,Giy具有缓冲能力 滴定开始时,溶液中主要是Glyt 起点:100%Gy+净电荷:+ 第一拐点: 50%Gy+,50%Gy平均净电荷:+05 第二拐点:100%Gly2净电荷:0等电点pl 第三拐点:50%Gi*,50%Gy平均净电荷: 终点: 1009Gly净电荷:-1 第一拐点:pH=pK+gfG*]G,pHpK=234 第二拐点:100Gly,净电荷为0,此时的pH值称氨基酸的等电点pl 第三拐点:pHpK2+ Hgl gly nGly}kK2=96 Gly的等电点 K IGlyH] IGly[H] [Gly] IGly I k,·K2=m13 等电点时:[G}(G+ 等电点时氢离子浓度用I表示 2=K1·K2Pl=12(K+pK2) 中性aapI= pKa -cooh pKa-Nh3 酸性ap=n-COOp 碱性aapl N
８ 原因：α-羧基pK1 在2.0左右，当pH>3.5，α-羧基以-COO-形式存在。α-氨基pK2 在9.4左右，当pH<8.0时，α-氨 基以α-NH+ 3形式存在。在pH3.5-8.0 时，带有相反电荷，因此氨基酸在水溶液中是以两性离子离子形式存在。 Gly 溶点232℃比相应的乙酸（16.5℃）、乙胺（-80.5℃）高，可推测氨基酸在晶体状态也是以两性离子形式存在。 图 2、氨基酸的两性解离和酸碱滴定曲线 HA A- + H+ pH=pKa / +Log[共轭碱]／[共轭酸] pOH=pKb /+Log[共轭酸]／[共轭碱] （1）pH > pKa / 时，[碱] > [酸] pH = pKa / 时，[碱] = [酸] pH < pKa / 时， [酸] > [碱] （2） pKa / 就是[碱] = [酸]时溶液的pH 值，Ka /就是此时溶液的[H+ ] （3）当[碱] = [酸]时，溶液的pH 值等于pKa / （4）Gly的两性解离和滴定曲线 图 3-14 Gly 的滴定曲线 在 pH2.34和pH9.60处，Gly具有缓冲能力。 滴定开始时，溶液中主要是Gly+。 起点：100% Gly+ 净电荷：+1 第一拐点： 50%Gly + ，50%Gly± 平均净电荷：+0.5 第二拐点： 100%Gly± 净电荷：0 等电点pI 第三拐点： 50%Gly± ， 50%Gly- 平均净电荷：-0.5 终点： 100% Gly- 净电荷：-1 第一拐点：pH=pK+lg[Gly± ]/[Gly+ ]，pH=pK1=2.34 第二拐点：100%Gly±，净电荷为0，此时的pH值称氨基酸的等电点pI。 第三拐点：pH=pK2+lg[Gly- ]/[Gly± ]=pK2=9.6 Gly 的等电点： 等电点时：[Gly-]=[Gly+] 等电点时氢离子浓度用I 表示 I 2=K1·K2 PI=1/2(pK1+pK2) [ ] [ ][ ] 1 + + = Gly Gly H K [ ] [ ] [ ] [ ] [ ][ ] 2 1 2 2 + − + − + • = • = Gly Gly K K H Gly Gly H K 2 . 2 . 2 . 3 3 R R pK NH pK a apI pK COOH pK a apI pK COOH pK NH a apI + + + − = − = − − = 碱性 酸性 中性
氨基酸在等电点状态下,溶解度最小 pH>pl时,氨基酸带负电荷,COOH解离成COO,向正极秘动。 pH=pl时,氨基酸净电荷为零 pH<p时,氨基酸带正电荷,NH解离成NH3,向负极移动。 以Gly为例 pH>234 正+1.0-+0.5 pH=234 正 +0.5 234pH597正0.5-0 597~H960负0--0.5 pH>960 负-05--10 问题 (1)pH=k时,缓冲能力最大,等电点时缓冲能力最小。为什么? (2)p的计算(氨基酸,寡肽,等电点时各组分的比例分析 (3)不同pH下的组成分析和电泳行为 pH>p时,氨基酸带负电荷,COOH解离成COO,向正极秘动 pH=pl时,氨基酸净电荷为零,溶解度最小 H<pl时,氨基酸带正电荷,NH解离成NH3,向负极移动 (4)利用pl和pK确定各种氨基酸适合的酸碱爱冲范围 (5)计算不同氨基酸水溶液的pH值 (6)绘制滴定曲线(Gu) 根据P页表37中Gu的数据(pK1 a-COOH219,pK2aNH967, pKRR-COOH425,pl32) ①绘出滴定曲线 ②指出Gu和G各一半时的pH值 ③指出Gu总是带正电荷的plH范围 ④指出Gu和Gu能作为缓中液使用的pH范围 ②Gu和G各50时pH为967 ③pH<322时Glu总带正电荷 ④Gu和Glur缓冲范围pH425左右 P92表37,氨基酸的表观解离常数和等电点 ①从表中(P2)可以看出,氨基酸的a-羧基pka在1826间,比典型羧基的pa(如乙酸pKa为476)要小很多 说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强⑩00倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的鐛响(场效应)。 图 ②表中只有Hs的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷 在生理条件下,只有Hs有缓冲能力 血红蛋白中Hs含量高,在血液中具很强的缓冲能力。 六、氨基酸的化学性质 a-NH2参加的反应 l、酰化反应
９ 氨基酸在等电点状态下，溶解度最小 pH > pI 时，氨基酸带负电荷，-COOH 解离成-COO-，向正极移动。 pH = pI 时，氨基酸净电荷为零 pH < pI 时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。 以 Gly 为例 pH>2.34 正 +1.0 — +0.5 pH=2.34 正 +0.5 2.34<pH<5.97 正 0.5 — 0 5.97<pH<9.60 负 0 — -0.5 pH>9.60 负 -0.5 — -1.0 问题： （1）pH = pKa / 时，缓冲能力最大，等电点时缓冲能力最小。为什么？ （2）pI 的计算（氨基酸，寡肽），等电点时各组分的比例分析 （3）不同pH 下的组成分析和电泳行为 pH > pI 时，氨基酸带负电荷，-COOH 解离成-COO-，向正极移动。 pH = pI 时，氨基酸净电荷为零，溶解度最小 pH < pI 时，氨基酸带正电荷，-NH2解离成-N+H3，向负极移动。 （4）利用pI 和pKa /确定各种氨基酸适合的酸碱缓冲范围 （5）计算不同氨基酸水溶液的pH 值 （6）绘制滴定曲线（Glu） 根据 P92 页表3-7 中Glu的数据（pK1α-COOH 2.19， pK2α-N+H39.67，pKR R-COOH4.25，pI 3.22） ①绘出滴定曲线 ②指出 Glu-和Glu=各一半时的pH值 ③指出 Glu 总是带正电荷的pH 范围 ④指出 Glu±和Glu-能作为缓冲液使用的pH范围 ①解：见图 ②Glu-和Glu=各50%时pH为9.67 ③pH<3.22时 Glu 总带正电荷 ④Glu±和Glu-缓冲范围pH4.25 左右 P92 表 3-7，氨基酸的表观解离常数和等电点 ①从表中（P92）可以看出，氨基酸的α-羧基pKa在1.8-2.6间，比典型羧基的pKa（如乙酸pKa为 4.76）要小很多， 说明氨基酸羧基的酸性此普通羧基强100倍以上。主要原因是氨基酸中α-氨基对α-羧基解离的影响（场效应）。 图 ②表中只有His 的咪唑基侧链在生理条件下不带电荷。 在生理条件下，只有His 有缓冲能力。 血红蛋白中His 含量高，在血液中具很强的缓冲能力。 六、 氨基酸的化学性质 （一） α-NH2参加的反应 1、酰化反应
①酰化试剂:苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被 用作氨基保护剂 ②丹磺酰氯(DNSc,5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯) DNS—c可用于多肽链NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定 图 NGy-Aa- -Ser-LeurPhe C→→→→DNs- Gly-Ala- Ser-LeurPhe C 水解DNS-、Ala、Ser、Leu、Phe DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光 ③蛋白质的合成 图 ④(生物体内)在酶和ATP存在条件下,羧酸也可与氨基酸的氨基作用,形成酰基化产物。 苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子 将经过匀浆的动物肝脏组织与Gy、苯甲酸和ATP混合保温,从混合液中可分离出N苯甲酸·Gy。 苯甲酸是食品防腐剂,在生物体内转变成N苯甲酰Gy后,可经尿排出 2、烷基化反应 a-氨基中的氮是一个亲核中心,能发生亲核取代反应。 ①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分,它是Gy甲基化的产物 图 ②强亲电的有机物能与αNH2发生烷基化反应 第一次大战中使用的芥子气,它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化,从而破坏蛋白质的正常功能。 图 ③ Sanger反应(24一二硝基氟苯,DNP) 二硝基苯基氨基酸(DNP氨基酸),黄色,层析法鉴定,被 Sanger用来测定多肽的N末端氨基酸。 ④ Edman反应(苯异硫氰酸酯,PIIC) 图 苯氨基硫甲酰衍生物(PIC-氨基酸)→苯乙内酰硫脲衍生物(PIH-氨基酸) PIH-氨基酸,无色,可以用层析法分离鉴定。被 Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸 氨基酸的α氨基与醛类反应,生成西佛碱。 图 西佛碱是某些酶促反应的中间产物(如转氨基反应的中间产物)。 ⑥含硫氨基酸的烷基化反应 硫原子也是亲核中心,可发生亲核取代反应。 生物体内,最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸(SAM),是由Mt与AIP作用得到的S-烷基化产物 图 在酶催化下,SAM可以使多种生物分子的氨基甲基化,如磷脂酰胆碱的生物合成
１０ ①酰化试剂：苄氧酰氯、叔丁氧甲酰氯、苯二甲酸酐、对-甲苯磺酰氯。这些酰化剂在多肽和蛋白质的人工合成中被 用作氨基保护剂。 ②丹磺酰氯（DNS-cl，5—二甲基氨基萘-1-磺酰氯） DNS—cl可用于多肽链—NH2末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定。 图 N Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C →→→→ DNS—Gly—Ala—Ser—Leu—Phe C 水解 DNS—Gly、 Ala、 Ser、 Leu、 Phe DNS-氨基酸在紫外光激发后发黄色荧光。 ③蛋白质的合成 图 ④（生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。 苯甲酸与Gly 的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。 将经过匀浆的动物肝脏组织与Gly、苯甲酸和ATP混合保温，从混合液中可分离出N-苯甲酸一Gly。 图 苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly 后，可经尿排出。 2、烷基化反应 α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。 ①肌氨酸是存在于生物组织中重要的组分，它是Gly甲基化的产物： 图 ②强亲电的有机物能与α-NH2发生烷基化反应。 第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。 图 ③Sanger 反应（2.4一二硝基氟苯，DNFP） 图 二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger 用来测定多肽的NH2末端氨基酸。 ④Edman反应（苯异硫氰酸酯，PITC） 图 苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸） → 苯乙内酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸） PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman 用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸 ⑤生成西佛碱的反应（Schiff） 氨基酸的α氨基与醛类反应，生成西佛碱。 图 西佛碱是某些酶促反应的中间产物（如转氨基反应的中间产物）。 ⑥含硫氨基酸的烷基化反应 硫原子也是亲核中心，可发生亲核取代反应。 生物体内，最重要的甲基化剂是S-腺苷甲硫氨酸（SAM），是由Met 与ATP作用得到的S-烷基化产物。 图 在酶催化下，SAM 可以使多种生物分子的氨基甲基化，如磷脂酰胆碱的生物合成