综上所述,除了传统的酶工程研究领域外,未来几年内的研究与发展重点应在以下几 个方面。 a.生物传感器的研究; b,.多酶反应器的研究 c.酶的改造和新酶的开发; d.酶的分离提纯技术; e.酶的应用领域的扩展和生产工艺的改进 2.1.2酶的固定化技术 随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展,工业化生产的酶越来越多,酶的应用领域 也越来越广泛,在食品、轻工、医药、化工、分析检测、环境保护和科学研究等方面的应 用均已取得了显著的成效。然而在酶的使用过程中,人们也注意到一些不足之处。例如 (a)酶的稳定性较差,在温度、pH值和无机离子等外界因素的影响下容易变性失活 (b)酶一般都是在水溶液中与底物反应,这样酶在反应系统中,与底物和产物混在一起, 反应结束后,即使酶仍有较高的活力却也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式不仅成 本较高,而且难于连续化生产。(c)酶反应后杂质与产物混在一起,给进一步的分离纯化 带来一定的困难等。为此,人们针对酶的不足寻求其改善方法 以上问题的解决办法之一就是采用固定化技术 固定化酶的研究始于20世纪50年代,1953年德国的 Grubhofer和 Sehieith采用聚氨 基苯乙烯树脂为载体,经重氮化活化后,分别与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶,核糖核酸酶 等结合,而制成固定化酶。1969年,日本的千烟一郎首次在工业生产规模应用固定化氨 基酰化酶从DI·氨基酸连续生产L氨基酸,实现了酶应用史上的一大突破。此后,固定 化技术迅速发展促使酶工程作为一个独立的学科从发酵工程中脱颖而出。 到目前为止,固定化酶的研究已经取得了很多成果,但是多局限于简单的胞外酶中的 水解酶类以及少数胞内酶。固定化水解酶类对大分子物质降解能力强,而对小分子无分解 能力,胞内的氧化还原酶类利用少。迄今为止,发现的2100种酶中有1/5的脱氢酶需要 NAD和NADP辅酶同时存在才能充分发挥酶的作用,而烟酰胺类(NAD和NADP)辅 酶的再生和固定化方法尚未解决。所以多酶体系的固定化尚有待于进一步研究 2.1.2.1酶的固定化 固定化酶是指固定在载体上,并在一定的空间范围内进行催化反应的酶,即将酶限制 在一定空间的同时,又不妨碍底物的自由扩散。与游离酶相比,固定化酶具有一系列优 点:(a)热稳定性提高;(b)可重复使用;(c)不需要在反应后进行催化物质与反应物质的 分离;(d)能够避免外源微生物对酶的污染和降解等。 将酶与水不溶性的载体结合在一起制备固定化酶的过程称为酶的固定化。酶的固定化 方法多种多样,适合酶的固定方法有以下四种:吸附法( adsorption),包埋法( entrap- ment),结合法( binding),交联法( linking),如图2-1所示。 (1)吸附法 采用非水溶性吸附剂将酶或含酶藺体吸附在其表面上而使酶固定化的方法称为物理吸 附法,简称为吸附法。 可用的吸附剂种类很多,如活性炭、高岭土、氧化铝、硅胶、硅藻土、多孔玻璃、胶 原、纤维素、羟基石灰石等
(a)物理吸附 b)商子交换 (c)共价键结合 (d)包埋 (e)交联 图2-1酶的不同固定化方法小意 酶与吸附剂的结合主要是靠氢键、范德华力、离子键等。酶与吸附剂结合的牢固程度 取决于溶液的pH值、离子强度、温度、溶剂性质和种类以及酶的浓度,所以为了得到更 好的吸附并使酶保持最高的活性,控制加,条件是十分重要的 采用吸附法制备固定化酶的技术操作简单,条件温和,同时由于吸附过程一般不需要 化学试剂,因此对酶的活性影响较小,但酶与吸附剂的结合主要靠物理作用,结合力较 弱,酶与吸附剂接合不牢固而容易脱落,影响其适用范圉和使用周期。 (2)包埋法 将酶或含酶菌体包埋在凝胶微小格子(格子型)中或将酶包裹在半透型的聚合物膜内 (微囊型),这样的酶固定化方法被称为包埋法。包埋法使用的多孔载体主要有琼脂、琼脂 糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等. 包埋法的待点一般是不产生化学修饰,对酶分子的活性影响较小,被包埋物不易渗 漏,底物分子可以在包埋结构中任意扩散;缺点是分子量大的底物在凝胶网格中扩散较困 难,因此不适合大分子底物的测定。 包埋法制备固定化酶或固定化菌体时,根据载体材料和方法的不同,可分为凝胶包埋 法和半透膜包埋法两大类。 ①凝胶包埋法凝胶包埋法是指将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中 制成一定形状的固定化酶或固定化菌体,大多数为球状或片状,也可按需要制成其 他形状 常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶,以及聚丙烯酰 胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。天然凝胶在包埋酶时条件温和,操作简便,对酶活性影 响甚少,但相对强度较差;而合成凝胶的强度高,对温度、pH值变化的耐受性强,但需 要在一定的条件下才能进行聚合反应,从而把酶包埋起来,在聚合反应过程中往往会引起 部分酶变性失活,因此应严格控制好包埋条件。 ②半透膜包埋法半透膜包埋法是指将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内, 制成固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等 半透膜的孔径为几十至几百纳米,比一般酶分子小,从而使固定化的酶不会从小球9 中漏出来。只有小于半透膜孔径的小分子底物和小分子产物可以自由通过半透膜,而
大于半透膜孔径的大分子底物或大分子产物却无法进出。因此半透膜包埋法仅适用于 底物和产物都是小分子物质的酶的固定化,例如脲酶、天门冬酰胺酶、尿酸酶、过氧 化氢酶等。 半透膜包埋法制成的固定化酶小球,直径一般只有几微米至几百微米,称为微胶囊。 制备时,一般将酶液分散在与水互不相溶的有机溶剂中,再在酶液滴表面形成半透膜,将 酶包埋在微胶囊之中 (3)结合法 选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合 法。根据酶与载体结合的化学键不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法。 ①离子键结合法通过离子键使酶与不溶性载体结合的固定化方法称为离子键结合 法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂,常用的有DEAE纤维素 TEAE纤维素、DEAE葡聚糖凝胶等。 用离子键结合法进行酶固定化,条件温和,操作简便。只需在一定的pH值、温度和 离子强度等条件下,将酶液与载体混合搅拌几个小时或者将酶液缓慢地流过处理好的离子 交换柱,就可使酶结合在离子交换剂上,制备得到固定化酶。 用离子键结合法制备的固定化酶,活性损失较少,但由于酶与载体是通过离子键进行 结合的,因此结合力较弱,酶与载体的结合不牢固,在pH值和离子强度等条件改变时酶 容易脱落。所以用离子键结合法制备的固定化酶,在使用时一定要严格控制好pH值、离 子强度和温度等操作条件 ②共价键结合法通过共价键将酶与不溶性载体结合的固定化方法称为共价键结合 法。共价键结合法所采用的载体包括无机载体和有机载体。有机载体如纤维素及其衍生 物、骨胶原、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等; 而无机载体主要有多孔玻璃、石墨等,在实践中使用的较少 酶分子中可以形成共价键的基团主要有游离氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基 等,要使载体与酶形成共价键,必须首先使载体活化,即借助于某种方法,在载体上引进 某一活泼基团,然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应,形成共价键。根据酶与载 体之间的结合形式,可以分为重氮法、叠氮法、溴化氰法和烷化法等固定化方法。其中以 重氮法较为多用。 共价键结合法的特点是结合牢固,酶分子不易脱落,载体不易被生物降解,使用寿 命长,缺点是操作步骤比较麻烦,酶活性可能因为发生化学修饰而降低,制备高活性 的固定化酶比较困难。其主要用于酶膜和免疫分子膜的制作,通常要求在低温(0℃) 低离子强度和生理pH值条件下操作,并常常加人酶的底物以防止酶的活性部位与载体 发生键合。 (4)交联法 此法借助双功能试剂使酶结合到惰性载体上 双功能试剂具有2个功能基团,能与酶分子中ε-氨基、a-氮基等发生共价交联。可供 交联的双功能试剂有戊二醛、双偶氮苯、甲苯-2-异氰酸4异硫氰酸、无水丁烯二酸乙烯 共聚物等,其中以戊二醛最为经常使用。 交联法广泛用于酶膜和免疫分子膜的制备,操作简单,结合牢固,在酶源较困难时 常常加入数倍于酶的惰性蛋白质作为基质。其缺点是进行固化时需要严格控制pH值
般在酶分子的等电点附近操作,交联剂浓度也要小心操作,如戊二醛本身能使酶分 子由责所且通堂凹?5以(休如仆斯、为宜九峦逛应巾以名不可出地△
裹2-2某些固定化酶的米门常数变化 载体 团定化方法 Km/(mmol/ L) 无花果酶 醋酸纤维 肽键结合法苯甲酰精氨酸乙酶 肌酸激酶 醋酸纤维素 肽键结合法AT肌酸 大冬酰胺酶 尼龙或聚脲 徵胶囊 AE葡糖 8.7 1.53 氮基酰化酶 DEAF纤维素 3.5 海膜,厚(470m 木瓜蛋闩酶 火棉胶 苯甲酰精氨酰胺 酶腰,厚(8.8mp硝基苯 碱性磷酸酯酶 火棉胶 磷酸 从表21中可以看出:不同载体、不同固定方法,可以使米门常数发生不同程度的 改变;不同的酶用桕同的载体、相同的固定化方法固定化,米门常数也有不同的变化 总的来说,酶在固定化以后,一般都表现为Kn增大,即K′m/Ka大于1。 对Km的变化有各种解释,但主要从载体电荷性质与底物电荷性质的异同来推测。 (4)最大反应速度的变化 固定化酶的最大反应速度(vm)与游离酶的vmx大多基本相同,少数例外。例如 用多孔玻璃的重氮化结合法所得的固定化转化酶的vn没有变化,而用聚丙烯酰胺凝胶包 埋的同一种酶的vm则比游离酶的vm增大30倍 另外,由于酶经过固定化后其热稳定性提高,所以固定化酶的最适宜反应温度往往高 于游离酶的最适宜反应温度。同时,固定化后酶的最适宜反应pH值也有所变化,但对于 不同载体、不同固定方法,甚至不同的酶采用相同的载体、相同的固定方法其最适宜反应 pH值也有不同的变化。 总之,固定化酶的反应特征与溶液酶相比,总会在某些方面有所不同,至于引起这种 变化的机理探讨目前则还很肤浅。所以对固定化酶设计的理论指导作用就显得无力,这是 值得引起重视的问题 但是如果是制备生产上使用的固定化酶,显然必须优先考虑使用试剂和原材料是否 得、便宜,制备方法是否简单易行等。当然,酶固定化之后,首先应当测定固定化酶的活 性,研究它的最适应反应条件(pH值、温度、底物浓度、离子强度等),考察固定化酶 的稳定性,以便改善载体和微环境的理化性质,以寻求制备的固定化酶适合生产应用 2.1.3酶在环境污染治理中的应用 2.1.3.1概述 酶在环境污染治理中的应用,最早可以追溯到采用微生物降解污染物质的应用。现在 普遍采用的活性污泥法和生物膜法就是典型的应用酶来治理环境污染的例子,只不过采用 的是做生物细胞内的酶系统。首先,利用微生物的自身特性使其自然固定下来,从而在局 部形成较高的徽生物浓度,然后利用微生物细胞内的酶系统来降解污染物质。例如,活性 污泥法,它是利用曝气池内的活性污泥微生物,不断地从其周围的环境中摄取污水中有机 的括性污泥表面,并与微生物细表面接触,在微生物透梅的催化作用下,潘过细壁 进人微生物细胞体内,小分子有机物能够直接透过细胞壁进入微生物体内,而如淀粉、蛋