系统实验之二 T淋巴细胞功能测定 付海英 fuhaiying612@yahoo.com.cn
系 统 实 验 之 二 T淋巴细胞功能测定 付海英 fuhaiying612@yahoo.com.cn
实验组 对照组 OVA(1mg/ml+CFA免疫小 生理盐水(500l)免疫 鼠腹腔内注射500川 小鼠腹腔内注射 实验流程 OVA+CFA加强免疫 生理盐水加强免疫小 小鼠500μl① 鼠500μl① After 1W 摘眼球取血 无菌取脾和胸腺② 1.双向免疫扩散试验③ 分离血清② 抗体效价 2.酶联免疫吸附试验(ELISA)④ 增殖功能 取脾和胸腺② 淋巴细胞转化试验②
实 验 流 程 1W 1.双向免疫扩散试验③ 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) ④ OVA (1mg/ml)+CFA免疫小 鼠腹腔内注射500 µl OVA+CFA加强免疫 小鼠500 µl ① 摘眼球取血 无菌取脾和胸腺② 分离血清② 2W 取脾和胸腺② 淋巴细胞转化试验② 生理盐水（500 µl )免疫 小鼠腹腔内注射 生理盐水加强免疫小 鼠500 µl ① 2W After 1W 实验组 对照组 抗体效价 增殖功能
实验内容 合小鼠摘眼球取血、 分离血清 一淋巴细胞转化试验
实验内容 小鼠摘眼球取血、 分离血清 淋巴细胞转化试验
教学要求 掌握小鼠血清的分离 掌握淋巴细胞转化试验 的基本原理及基本操作
教学要求 ❖ 掌握小鼠血清的分离 ❖ 掌握淋巴细胞转化试验 的基本原理及基本操作
淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test) 原理 。检测方法 操作步骤 。应用
淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test) ❖ 原理 ❖ 检测方法 ❖ 操作步骤 ❖ 应用 原理 Lymphocytes(B/T) Mitogens Specificity Ag Proliferation Transformation Lymphoblast Nucleic Acid↑ Protein ↑ 检测方法 ◼◼ 形态学方法 ◼◼ 33HH-TdR掺入法 ◼◼ MTT MTT法法 ((本次实验采用)) 形态学方法 ◼◼ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细 胞的胞的33-44倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并 形成空泡。 ◼◼ 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和 核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、 过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细 胞胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200 200个细胞， 按下式计算转化率： 100% + = 转化的淋巴细胞数 未转化的淋巴细胞数 转化的淋巴细胞数 转化率 33HH-TdR掺入法 G0G0 G1G1 有 丝 分裂 原 特 异 性抗 原 SS Pr,RNA,D NA 前 体 物质 DNA↑↑ New DNA 3H-T dR 3 TdR 3HH-TdR cpm 对照管 值 刺激管 值 cpm ConA cpm SI = MTT法 活活 / /增殖增殖 期的细胞 线粒体 能 量 代谢 琥珀酸脱氢酶 MTT MTT MT T MT T掺入掺入 还还 原原 甲甲臜臜颗粒颗粒 formazan 细胞内 / 测测AA值值 溶解溶解 /周围周围 对照管 值 刺激管 值 A ConA A SI = 操 作 步 骤 1W 1.双向琼脂扩散试验 2.酶联免疫吸附试验（ E LISA） 1.1.双向琼脂扩散试验 2.2.酶联免疫吸附试验（ E LISA）） OVA OVA免疫免疫//生理盐水 无菌取脾 /胸腺 研 磨 成单 细胞 悬液 (1/ 2脾 /胸 腺 +2ml IM DM（无 FCS) 无菌取脾 /胸腺 研 磨 成单 细胞 悬液 (1/ 2脾 /胸 腺 +2ml IM DM（无 FCS) 摘眼取血 获取血清 细胞计数 【?/ ml】 取 20µ l细胞 +980µ l的计 数液 细胞计数 【?/ ml】 取 20µ l细胞 +980µ l的计 数液 加板 (三复 孔 ) (加 法 见附 图 ) 加板 (三复 孔 ) (加 法 见附 图 ) 调细胞浓度 ?/ ml× A=1.5× 1× 107 调细胞浓度 ?/ ml× A=1.5× 1× 107 37℃ 5%C O 2 培养 48小时 37℃ 5%C O 2 培养 48小时 培 养 终止 前 2小 时加 入 MTT (5mg / ml ) 1 0µ l/ well 培 养 终止 前 2小 时加 入 MTT (5mg / ml ) 1 0µ l/ well 37℃ 5% C O2 继 续 培养 2小时 37℃ 5% C O2 继 续 培养 2小时 2000rp m 5min 2000rp m 5min 小 心 弃去 上清 ，加 入 100µ l/ 孔 DMS O振 荡 ， 使颗 粒全 部溶 解 小 心 弃去 上清 ，加 入 100µ l/ 孔 DMS O振 荡 ， 使颗 粒全 部溶 解 酶 标 仪测 吸光 度值 ： A570n m 结 果 判定 ： 结 果 判定 ：SI= SI=Co n A Co n A孔孔AA值值//对 照孔 对 照孔AA值值 淋巴细胞转化试验的应用 ◼◼ 检查患者细胞免疫功能 ◼◼ 估计疾病的疗效及预后 ◼◼ 细胞配型抗原的检查：移植免疫 ◼◼ 免疫药理学：具有免疫调节的药物、 保健品、中草药及生物制品 ◼◼ 卫生毒理学的研究