表6-9常用同工酶及其亚型的分析方法 方法 同工酶(或亚型)的性质差异 同工酶、亚型 电泳法 电荷不同 所有同工酶、亚型 区带电泳、等电聚焦 色谱法 离子交换色谱 电荷不同 CK,LD 免疫分析法 免疫抑制法 特异性抗体反应性不同 CK、LD、ACP 免疫化学测定法 特异性抗体反应性不同 CK、LD、ACP、ALP、AMY RIA、EIA、FA、CLA 动力学分析法 底物特异性分析法 底物Km、亲和力不同 ACP、CK、LD(a-羟丁酸) 抑制剂分析法 对小分子量的抑制剂的特异性抑LD(草酸)、ACP(L-酒石酸)、ALP 制不同 (苯丙氨酸)、ChE(氟和可卡因) pH分析法 最适pH不同 LD、AST 热失活分析法 热稳定性不同 LD、ALP 蛋白酶水解法 对蛋白水解酶敏感度不同 LD、AST
一)电泳法 1.方法 电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、 分离效果良好,并且一般不会破坏酶的天然状态。 目前国内外的一些自动化电泳分析系统则多 采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质,采 用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分 离与鉴定。 此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚 焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤 主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用 电泳法进行区带分离的原理与其他蛋 白电泳相似
(一)电泳法 1．方法 电泳法的使用最为广泛。此法简便、快速、 分离效果良好，并且一般不会破坏酶的天然状态。 目前国内外的一些自动化电泳分析系统则多 采用分辨率更高的琼脂糖凝胶作为支持介质，采 用高压或常压电泳进行各种同工酶及其亚型的分 离与鉴定。 此外还可采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚 焦电泳及毛细管电泳等技术进行分析。测定步骤 主要分为区带分离、活性显色和检测结果等。用 电泳法进行区带分离的原理与其他蛋 白电泳相似
2.显色染料 常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易 溶于水,难溶于一般的有机溶剂。 酶学中只是利用所进行的偶合反应,由所生成 不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测,四唑盐起 着受氢体的作用,如将四唑盐及双四唑盐分别还原 成紫红色的甲躜(for mazan)和紫蓝色的双甲躜。 常用的四唑盐有:硝基四唑蓝盐(NBT),碘化硝 基四唑盐(INT)、甲基噻唑四唑盐(MTT)等。其中NBT 生成的色素难以溶解,在局部区域染色良好,使用 最多
2．显色染料 常用显色染料有偶氮染料和四唑盐等。它们易 溶于水，难溶于一般的有机溶剂。 酶学中只是利用所进行的偶合反应，由所生成 不同颜色的偶氮色素进行同工酶谱检测，四唑盐起 着受氢体的作用，如将四唑盐及双四唑盐分别还原 成紫红色的甲躜(formazan)和紫蓝色的双甲躜。 常用的四唑盐有：硝基四唑蓝盐(NBT)，碘化硝 基四唑盐(INT)、甲基噻唑四唑盐(MTT)等。其中NBT 生成的色素难以溶解，在局部区域染色良好，使用 最多
3.扫描定量 显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫 描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小 薄片,分别浸泡在含缓冲液的试管中,低温下 将酶条带洗脱,再进行比色分析,亦可计算出 各同工酶或亚型区带的活力
3．扫描定量 显色后的区带一般用光密度计或荧光计扫 描定量分析。或将薄膜或凝胶切割成小条或小 薄片，分别浸泡在含缓冲液的试管中，低温下 将酶条带洗脱，再进行比色分析，亦可计算出 各同工酶或亚型区带的活力
\e⊕ 正常 急性心肌梗死 慢性肝炎 溶血性贫血 图6-6正常和几种病理状况时血清LD 同工酶的琼脂糖凝胶电泳分离图谱 图66为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工 酶谱(图谱中从左至右分别为LD1-LD5)
图6-6为琼脂糖凝胶电泳分离的血清LD同工 酶谱(图谱中从左至右分别为LD1-LD5)