6.平板凝集试验与试管凝集试验的关系见表1-2。 表1-2平板凝集试验与试管凝集试验的关系 平板凝集80uL 40uL 20uL 10uL 相当于试管凝集 1:25 1:50 1:100 1:200 7.判定标准：同试管凝集试验 8.注意：对于阳性及可疑的被检血清需用试管凝集试验进行验证 (三)虎红平板凝集试验 这种试验是快速平板凝集试验。抗原是布氏杆菌加虎红制成。虎红平板凝集试验可与试 管凝集试验及补体结合试验效果相比，具有操作简单、快速、特异性强的优点。 1.,被检血清和布氏杆菌病虎红平板凝集抗原各30μL滴于玻璃板的方格内，每份血清名 用一支牙签或火柴棒混合均匀。在室温(20℃)4-10in内记求反应结果。同时以阳、阴性 血清作对照。 2.结果判定：在阳性血清及阴性血清试验结果正确的前提下，被检血清出现任何程度 的凝集现象均判为阳性，完全不凝集的判为阴性，无可疑反应。 3.注意：抗原用前充分摇匀，抗原和被检血清用前应放室温30-60min后再进行试验。 (四)鸡白痢平板凝集试验 1,被检鸡血清和鸡白痢平板凝集抗原各1滴（约30μL)滴于玻板或载玻片上，用牙签 或火柴棒充分混合。 2.结果判定：在室温(20℃)下，观察30-60s,凝集者为阳性，不凝集者为阴性。 [思考题】 1,凝集反应的原理是什么？ 2,哪些因素影响细菌凝集试验？ 3.凝集试验中为什么要设阳性、阴性血清及抗原对照？
实验二沉淀试验 可溶性抗原（如细菌浸出液、含菌病料浸出液、病毒、血清以及其他来源的蛋白质、多 糖、类脂等)与其相应的抗体结合后，在电解质参与下，形成肉眼可见的白色沉淀，称为沉 淀反应(Precipitation reaction)。沉淀反应中的抗原称为沉淀原(Precipitinogen),抗体称为 沉淀素(Precipitin)。 沉淀反应主要包括有环状沉淀试验、琼脂扩散沉淀试验及免疫电泳等。 目的要求] 1.掌握炭疽环状沉淀试验的操作方法和结果观察。 2.掌握琼脂扩散沉淀试验的原理和操作方法。 3.了解对流免疫电泳的一般原理和操作技术。 材料与试剂] 1.口径0.4cm的小试管，毛细滴管，载玻片，平皿，烧杯没，打孔器，针头，酒精灯， 加样器（移液器），滴头，电泳槽，电泳仪等。 2.生理盐水，8.5%NaC1溶液，0.5%石炭酸生理盐水，巴比妥缓冲液，琼脂粉等。 3.炭疽沉淀抗原（炭疽标准抗原），炭疽沉淀素血清，待检抗原。 4.禽流感琼扩抗原，贪流感阳性血清，待检鸡血消：兔抗猪【gG,猪血清，鸡血清，兔 血清、牛血清，羊血清等。 5.小鹅瘟琼扩抗原，小鹅瘟抗血清：鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织 浸提液)，鸡传染性法氏囊病阳性血清。 [实验内容及操作方法] (一)环状沉淀试验 环状沉淀试验(Ring precipitation test)是最早的沉淀反应。目前在链球菌的分类、鉴定， 昆虫吸血性能及所吸血液来自何种动物的鉴别，肉品种属鉴定及炭疽尸体与皮张的检验工作 中仍然应用。以炭疽环状沉淀反应为例，此反应又称Asoi氏反应。 1.待检抗原的制备 (1)取疑为炭疽死亡动物的实质脏器1g放入小烧杯中剪碎，加生理盐水5-101，煮沸 30min,冷却后用滤纸过滤使之呈清澈透明的液体，即为待检抗原。 6
(2)如待检材料是皮张、兽毛等，可采用冷浸法。先将样品高压灭菌30mi后，皮张剪 为小块并称重，加5-10倍的0.5%石炭酸生理盐水，置室温浸泡10-24h。用滤纸过滤2-3 次，使之呈清明的液体，此即为待检抗原。 2.加样：取3支口径0.4cm的小试管，在其底部各加约0.1ml的炭疽沉淀素血清（用 毛细滴管加，注意液面勿有气泡)。取其1支，用毛细滴管将待检抗原沿着管壁轻轻加入使 重叠在炭疽沉淀素血清之上，上下两液间有一整齐的界面，注意勿产生气泡。另2支小试管， 一支加炭箱沉淀抗原，另一支加生理盐水，方法同上，作为对照。 3.结果判定：5-l0加内判定结果，上下重叠两液界面上出现乳白色环者，为炭疽刚 性。对照组中，加炭疽沉淀抗原者应出现白环，而加生理盐水者应不出现白环。 4.注意：观察结果时，可将一只手放在小试管对测的适当位置上遮挡光线，有利于看 到白色沉淀环。 (二)琼脂扩散沉淀试验 琼脂扩散沉淀试验(Agar gel precipitation test,AGPT)是沉淀反应的一种形式。物质 自由运动形成扩散现象，扩散可以在各种介质中进行。1%琼脂凝胶形成网状构架，空隙中 是98%-99%的水，允许分子量在200ku以下分子通过。绝大多数可溶性抗原和抗体的分子 量在200ku以下，因此可以在琼脂凝胶中自由扩散，所受阻力甚小。二者在琼脂凝胶中相遇， 在最适比例处结合成复合物，此复合物因颗粒较大而不能扩散，故形成沉淀带。 本试验可用已知抗体检测样品中的抗原，也可用已知抗原检测血清样品中的抗体。 1.琼脂板制各：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水或8.5%aC1溶液（贪类），煮 沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左右时倒入平皿中，厚度为2-3m。 2.打孔：用打孔器在琼脂凝胶板上按7孔梅花图案打孔，孔径约3-5mm,中心孔和周 围孔间的距离约为3-5mm。挑出孔内琼脂凝胶，注意不要挑破孔的边缘。 3封底：在火焰上缓缓加热，使孔底琼脂凝胶微微融化，以防止孔底边缘渗漏。 4,加样：以毛细滴管（或加样器）将样品加入孔内，注意不要产生气泡，以加满为度。 (1)血清流行病学调查：将禽流感琼扩抗原置中心孔，周围1、3、5孔加禽流感阳性 血清，2、4、6孔分别加待检鸡血清，每加一个样品应换一个滴头。 (2)抗血清效价测定：将猪血清（抗原）加入中心孔，将兔抗猪1gG(抗体)作2倍 比稀释，即1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等，分别加至周围孔中。或者是将小鹅瘟琼扩抗 原加入中心孔，周围孔加入1：2、1：4、1：8、1：16、1：32等稀释的小鹅瘟抗血清
(3)抗原检测：将兔抗猪【gG(抗血清)加入中心孔，将待测抗原（猪血清、鸡血清、 兔血清、牛血清、羊血清等)置于周围孔中。或者是将鸡传染性法氏囊病阳性血清加入中心 孔，周围孔加鸡传染性法氏囊病琼扩抗原（或待检法氏囊组织浸提液）。 5.感作：将琼脂凝胶板加盖保湿，置于37℃温箱，24-48h后，判定结果 6.结果判定 (1)血清流行病学调查：待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性。待检血 清无沉淀带或所出现的沉淀带与阳性对照的沉淀带完全交义者判为阴性。 (2)抗血清效价测定：以出现沉淀带的血清最高稀释倍数为抗血清的AGP效价。 (3)抗原检测：兔抗猪IgG与猪血清孔之间有明显沉淀带，与其他血清孔之间不形成 沉淀带。鸡传染性法氏囊病阳性血清与鸡传染性法氏囊病琼扩抗原孔之间出现沉淀带，如与 待组织浸提液孔之间出现沉淀带，说明该法氏粪组织中有鸡传染性法氏囊病病毒抗原。 (三)对流免疫电泳 在州值86的琼脂凝胶中，抗体球蛋白带有微弱的负电荷，在电冰时，由于电渗作用 的影响，抗体球蛋白反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质带负电荷，在电泳力的作用下向正 极移动。二者在两孔之间相遇，形成肉眼可见的白色沉淀线。 本法由于抗原抗体分子在电场作用下定向运动，限制了自由扩散，从而提高了敏感性， 它较琼脂扩散试验敏感性高10-16倍，并可大大缩短沉淀线出现的时间，适用于快速诊断。 1.琼脂板制备：用巴比妥缓冲液配制1%-1.5%琼脂凝胶板，厚度2-3mm。 2.打孔：孔径3-5mm,孔距4-10mm，一张载玻片可打12个孔，挑去孔内琼脂，封底 3.加样：一对孔中，一孔加已知（或待测）抗原，另一孔加待测（或已知）抗体。 4.电泳：在电泳梧内加入H86的巴比妥缓冲液，将滤纸片放入缓冲液内浸湿搭桥。 将抗原孔置于负极端。电压2.5-6/cm,或电流强度3-5mA/cm,电泳时间为30-90min。 5.结果观察：断电后，将凝胶板置于灯光下，村以黑色背景观察。阳性者则在抗原与 抗体孔之间形成一条清楚致密的白色沉淀线。如沉淀线不清晰，可将琼脂凝胶板放在湿盒中 37℃数小时或置电泳槽过夜再观察。 [思考题] 1,进行环状沉淀试验时，注意事项是什么？ 2.琼脂扩散沉淀试验的操作方法及其应用。 3.对流免疫电泳的原理是什么？