三、实验流程 防己粗粉 乙醇提取回收溶剂 糖浆 酸化 酸水液 过滤,以水洗渣,滤液以浓氨 碱化至pH9-10,氯仿萃取 碱水层 氯仿层 正丁醇萃取 2%NaOH萃取 回收溶剂 轮环藤酚碱 NaOH层 氯仿层 氯化铵调pH9-10水洗中性,脱水 ↓氯仿萃取 回收溶剂,抽松 氯仿层 水洗中性,脱水抽松物(甲乙素) 氧化铝柱层析分离 ↓回收溶剂 环己烷一丙酮洗肟 小檗胺 (亲脂酚性碱) 甲素 乙素 (亲脂非酚性碱 TLC检识 四、实验方法 (一)总生物碱的提取 称取粉防已粗粉200g,用95%EtOH回流提取二次(500ml1小时,400m45 分钟),两次提取液合并,减压回收乙醇至无醇味,得糖浆状物 (二)分离 1.亲脂性生物碱与亲水性生物碱的分离 在糖浆状总提取物中加入1%的盐酸约2σ0ml,充分搅拌使生物碱溶解,放 置。过滤,滤渣用水洗涤2~-3次后弃去,滤液合并后移至500ml分液漏斗中加 15 ml CHCl3,再滴加浓氨水调pH9-10,振摇萃取(此时再向水层滴加浓氨水至 无沉淀析出),静置分层后,放出CHCl3层,碱水层以新CHCl3萃取4次,依次 加入80ml×4,最后一次萃取的CHCl层中应基本没有生物碱时认为CHCl3萃取 基本完全(取CHCl3液滴在滤纸上, Drangedorff试剂显色不明显为止)。合并 CHCl3液即为亲脂性生物碱的提取液。碱水层则为亲水性生物碱,CHCl3提取液 和碱水层分别在下述2、3项中处理 亲脂性生物碱中酚性与非酚性碱的分离
6 三、实验流程 防己粗粉 乙醇提取，回收溶 剂 糖浆 酸化 酸 水 液 过 滤，以水洗渣，滤液以浓氨 水碱化至pH9-10，氯仿萃取 碱水层 正丁醇萃 取 氯仿 层 2％NaOH萃取 NaOH层 氯化铵调 pH9-10 氯仿萃取 氯仿层 水洗中性，脱水 回收溶剂 小 檗胺 （亲脂 酚性 碱） 氯仿 层 水洗中性，脱水 回收溶剂，抽松 抽松物 （甲乙素） 氧化铝柱层析分离 环己烷－丙酮洗脱 甲素 乙素 （亲脂非酚性碱） 回收溶剂 轮环藤 酚碱 TLC 检识 四、实验方法 （一）总生物碱的提取 称取粉防已粗粉 200g，用 95%EtOH 回流提取二次（500ml 1 小时，400ml 45 分钟），两次提取液合并，减压回收乙醇至无醇味，得糖浆状物。 （二）分离 1．亲脂性生物碱与亲水性生物碱的分离 在糖浆状总提取物中加入 1%的盐酸约 200ml，充分搅拌使生物碱溶解，放 置。过滤，滤渣用水洗涤 2~3 次后弃去，滤液合并后移至 500ml 分液漏斗中加 150ml CHCl3，再滴加浓氨水调 pH 9-10，振摇萃取（此时再向水层滴加浓氨水至 无沉淀析出），静置分层后，放出 CHCl3 层，碱水层以新 CHCl3 萃取 4 次，依次 加入 80ml×4，最后一次萃取的 CHCl3 层中应基本没有生物碱时认为 CHCl3 萃取 基本完全（取 CHCl3 液滴在滤纸上，Drangedorff 试剂显色不明显为止）。合并 CHCl3 液即为亲脂性生物碱的提取液。碱水层则为亲水性生物碱，CHCl3 提取液 和碱水层分别在下述 2、3 项中处理。 2．亲脂性生物碱中酚性与非酚性碱的分离
上述CHCl3液置分液漏斗中,用2%NaOH水溶液萃取1~2次,每次50ml, 此时碱水层色已很浅,示酚性脂溶性碱已基本被萃取到NaOH层,合并NaOH 萃取液,将NaOH层与CHCl3液分置2个分液漏斗中,可同时操作: (1)NaOH层加固体NH4Cl至pH9左右,然后CHCl萃取2次(80m, 50m),第2次CHCl3层生物碱反应应极弱示萃取基本完全,弃去水相,合并CHCl3 层并用蒸馏水洗至中性,加无水Na2SO4脱水24小时以上,过滤,回收CHCl3 得粗酚性生物碱。 (2)CHCl3层用蒸馏水洗至中性,加无水Na2SO4脱水24小时以上,过滤, 回收CHCl3,残留物抽松,得非酚性生物碱的抽松物,称重,取出50mg作第4 3.季铵型生物碱的分离 碱水液用正丁醇萃取(50m×2),回收正丁醇,得轮环藤酚碱粗品。 4.非酚性碱中汉防已甲素和乙素的分离纯化。 柱层析分离条件 吸附剂,中性Al2O3300-200目,ⅡⅢ级,装柱15cm 样品:拌样上样,取非酚性碱的抽松物50mg,用少量丙酮溶解后,于吸附 剂中分散均匀,边加热挥去丙酮。 装柱:湿法装柱(干法装柱也可以) 洗脱剂:环已烷-丙酮(2:1)。 将样品加于柱顶,倒入洗脱剂,洗脱开始,流速控制在5ml/分,收集各流份 (lom~l5ml/份),各流份回收溶剂,用硅胶GTLC检査,合并相同流份,回收 溶剂至干,分别用(CH3)2CO重结晶12次,可得汉防已甲素、乙素精品。 附:(1)湿法装柱法。取吸附剂25g左右于烧杯中,加洗脱剂完全浸润,搅 匀,排除气泡,于色谱柱中加入小块棉花,并用洗脱剂润湿(排除气泡),打开 色谱柱活塞,将吸附剂缓缓倒入柱内,待其自然沉降后即可。柱顶留5m左右洗 脱剂,倒入拌好的样品,敲平(此时洗脱剂不能被样品吸干,应有余量),即可 开始层析 (2)干法装柱法。打开柱活塞,倒入干的吸附剂装15cm高,敲匀,然后 倒入拌样的吸附剂再敲平,沿柱壁均匀加入洗脱剂,待流岀第1滴流岀液时,加 满洗脱剂,开始层析 (3)硅胶GTLC制备与层析,铺板,一块板用吸附剂1.5g,板规格15×5cm, 每克吸附剂用0.5% CMC-Na3m,在乳钵中研匀后铺板,每组铺板3块,自然干 燥后用前在100-105℃活化30分钟 7
7 上述 CHCl3 液置分液漏斗中，用 2%NaOH 水溶液萃取 1~2 次，每次 50ml， 此时碱水层色已很浅，示酚性脂溶性碱已基本被萃取到 NaOH 层，合并 NaOH 萃取液，将 NaOH 层与 CHCl3 液分置 2 个分液漏斗中，可同时操作： （1）NaOH 层加固体 NH4Cl 至 pH 9 左右，然后 CHCl3 萃取 2 次（80ml， 50ml），第2次 CHCl3层生物碱反应应极弱示萃取基本完全，弃去水相，合并 CHCl3 层并用蒸馏水洗至中性，加无水 Na2SO4 脱水 24 小时以上，过滤，回收 CHCl3， 得粗酚性生物碱。 （2）CHCl3 层用蒸馏水洗至中性，加无水 Na2SO4 脱水 24 小时以上，过滤， 回收 CHCl3，残留物抽松，得非酚性生物碱的抽松物，称重，取出 50mg 作第 4 项。 3．季铵型生物碱的分离 碱水液用正丁醇萃取（50ml×2），回收正丁醇，得轮环藤酚碱粗品。 4．非酚性碱中汉防已甲素和乙素的分离纯化。 柱层析分离条件： 吸附剂，中性 Al2O3 300-200 目，Ⅱ-Ⅲ级，装柱 15cm。 样品：拌样上样，取非酚性碱的抽松物 50mg，用少量丙酮溶解后，于吸附 剂中分散均匀，边加热挥去丙酮。 装柱：湿法装柱（干法装柱也可以） 洗脱剂：环已烷-丙酮 （2:1）。 将样品加于柱顶，倒入洗脱剂，洗脱开始，流速控制在 5ml/分，收集各流份 （10ml～15ml/份），各流份回收溶剂，用硅胶 GTLC 检查，合并相同流份，回收 溶剂至干，分别用(CH3)2CO 重结晶 1-2 次，可得汉防已甲素、乙素精品。 附：（1）湿法装柱法。取吸附剂 25g 左右于烧杯中，加洗脱剂完全浸润，搅 匀，排除气泡，于色谱柱中加入小块棉花，并用洗脱剂润湿（排除气泡），打开 色谱柱活塞，将吸附剂缓缓倒入柱内，待其自然沉降后即可。柱顶留 5ml 左右洗 脱剂，倒入拌好的样品，敲平（此时洗脱剂不能被样品吸干，应有余量），即可 开始层析。 （2）干法装柱法。打开柱活塞，倒入干的吸附剂装 15cm 高，敲匀，然后 倒入拌样的吸附剂再敲平，沿柱壁均匀加入洗脱剂，待流出第 1 滴流出液时，加 满洗脱剂，开始层析。 （3）硅胶 GTLC 制备与层析，铺板，一块板用吸附剂 1.5g，板规格 15×5cm， 每克吸附剂用 0.5%CMC-Na 3ml，在乳钵中研匀后铺板，每组铺板 3 块，自然干 燥后用前在 100-105℃活化 30 分钟
色谱条件 对照品:甲素、乙素。 展开剂:CHCl31CH3)2CO(1:1)展开前浓氨水预饱和15分钟 显色剂:改良 Langendorf试剂 (三)鉴识 1.色谱鉴识 (1)硅胶GCMC板TLC 条件均与柱色谱检识TLC条件一致,结果参照柱色谱检识的结果,可不重 复 (2)叔胺碱多缓冲纸色谱 I多缓冲滤纸的制备 取滤纸条(2×30cm),离下端6cm处开始用铅笔划一原点线,然后向上每 隔2cm划一平行线。并自下而上在每隔2cm的行间顺次涂布p值不同的缓冲 液(60,54,50,4.6,40)。如图示 4.0 5.0 54 6.0 涂布时勿使缓冲液渗出线外,涂完后将滤纸悬挂在空中自然干燥。 Ⅱl点样 分别在两条滤纸起始线上点下列样品的氯仿溶液 汉防已甲素 汉防已乙素 Ⅲ展开 溶剂皿内置展开剂CHCl-CH3)2O(1:1)(水预先饱和),将点样后的滤纸悬 挂在筒内,密闭,饱和30分钟后展开。 Ⅳ显色 喷以改良 Dragendorf试剂 2.定性反应 8
8 色谱条件： 对照品：甲素、乙素。 展开剂：CHCl3-(CH3)2CO （1:1）展开前浓氨水预饱和 15 分钟。 显色剂：改良 Drangendorff 试剂 （三）鉴识 1．色谱鉴识 （1）硅胶 GCMC 板 TLC 条件均与柱色谱检识 TLC 条件一致，结果参照柱色谱检识的结果，可不重 复。 （2）叔胺碱多缓冲纸色谱 Ⅰ多缓冲滤纸的制备 取滤纸条（2×30cm），离下端 6cm 处开始用铅笔划一原点线，然后向上每 隔 2cm 划一平行线。并自下而上在每隔 2cm 的行间顺次涂布 pH 值不同的缓冲 液（6.0，5.4，5.0，4.6，4.0）。如图示 甲 乙 总 6.0 5.4 5.0 4.6 4.0 涂布时勿使缓冲液渗出线外，涂完后将滤纸悬挂在空中自然干燥。 Ⅱ点样 分别在两条滤纸起始线上点下列样品的氯仿溶液。 汉防已甲素 汉防已乙素 Ⅲ展开 溶剂皿内置展开剂 CHCl3-(CH3)2O（1:1）（水预先饱和），将点样后的滤纸悬 挂在筒内，密闭，饱和 30 分钟后展开。 Ⅳ显色 喷以改良 Dragendorff 试剂 2．定性反应
取甲素(乙素)溶于稀HCl中,分置4支试管中,加下列试剂1~3滴。观 察现象 A碘化汞钾试剂 B碘一一碘化钾试剂 C硅钨酸试剂 D碘化铋钾试剂 五、思考题 有机溶剂提取必须用什么方式?为什么? 2.减压回收较常压回收有哪些特点?影响减压回收速度的关键是什么,如 何控制 3.萃取操作的好坏对实验结果会有什么影响,为什么说分离是影响产品产 量及质量的主要因素。 4.怎样防止产生乳化,怎样消除乳化? 为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置? 6.何时有机相需要脱水干燥,何时不必? 7.如何用TLC确定柱色谱条件(包括干柱柱色谱,洗脱柱层析)? 8.为什么PC中的展开剂必须用固定相预先饱和? 9.什么叫假阳性和假阴性反应?有什么意义,能消除吗? 10.粉防已中各种生物碱的分离原理是什么? 11.为什么用NH3或NH4Cl调pH,而不用其它碱和酸 六、主要参考文献 1.药学杂志(日) 107:1928 77;807;1957 82;741;1962 87;316;1967 2.化学学报 23:405;1957 3.中成药研究 3:36;1980 4.中草药通讯 l:10:2;8;1976 3;107;1950 6. Chinese J Physiol 9(3);267,1935 13(2);167,1938
9 取甲素（乙素）溶于稀 HCl 中，分置 4 支试管中，加下列试剂 1~3 滴。观 察现象。 A 碘化汞钾试剂 B 碘——碘化钾试剂 C 硅钨酸试剂 D 碘化铋钾试剂 五、思考题 1．有机溶剂提取必须用什么方式？为什么？ 2．减压回收较常压回收有哪些特点？影响减压回收速度的关键是什么，如 何控制？ 3．萃取操作的好坏对实验结果会有什么影响，为什么说分离是影响产品产 量及质量的主要因素。 4．怎样防止产生乳化，怎样消除乳化？ 5．为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置？ 6．何时有机相需要脱水干燥，何时不必？ 7．如何用 TLC 确定柱色谱条件（包括干柱柱色谱，洗脱柱层析）？ 8．为什么 PC 中的展开剂必须用固定相预先饱和？ 9．什么叫假阳性和假阴性反应？有什么意义，能消除吗？ 10．粉防已中各种生物碱的分离原理是什么？ 11．为什么用 NH3 或 NH4Cl 调 pH，而不用其它碱和酸。 六、主要参考文献 1．药学杂志（日） 48；107；1928 77；807；1957 82；741；1962 87；316；1967 2．化学学报 23；405；1957 3．中成药研究 3；36；1980 4．中草药通讯 1：10；2；8；1976 5．Science Record 3；107；1950 6．Chinese J Physiol 9（3）；267，1935 13（2）；167，1938