荧光抗体的制备 荧光素要求 有能与蛋白质形成共价健的化学基团,与蛋白质结合后不易解离,而未结 合的色素及其降解产物易于清除。 荧光效率高,与蛋白质结合后,仍保持较高的荧光效率。 冷荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 今与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 标记方法简单、安全无毒。 今与蛋白质的结合物稳定,易于保存
❖有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结 合的色素及其降解产物易于清除。 ❖荧光效率高，与蛋白质结合后，仍保持较高的荧光效率。 ❖荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ❖与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。 ❖标记方法简单、安全无毒。 ❖与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 荧光抗体的制备 荧光素要求
荧光抗体的制备 抗体的荧光素标记 ☆标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITc的异硫氰基在碱性溶液 中形成硫碳酰胺键,使抗体与FITC结合成荧光抗体。 ☆标记方法 搅拌法:适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短, 荧光素用量少,但有非特异性染色。 透析法:适于标记样品量少,蛋白含量低的抗体。标记比较匀 非特异染色较低
荧光抗体的制备 抗体的荧光素标记 ❖标记原理:利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液 中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。 ❖标记方法: 搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间 短， 荧光素用量少，但有非特异性染色。 透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀， 非特异染色较低
荧光抗体的制备 荧光抗体的纯化 ☆去除游离荧光素及其降解产物:透析或凝胶过滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体:阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体:动物肝粉吸收或固相抗原吸收
❖去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 ❖去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 ❖去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收 荧光抗体的制备 荧光抗体的纯化
荧光抗体的制备 荧光抗体的鉴定 冷荧光素与蛋白结合率: 2.87×A495m A280m-0.35×A495m 抗体效价:双向免疫扩散试验 抗体特异性:吸收试验、抑制试验 冷抗体抗体特异性染色滴度:倍比稀释
❖荧光素与蛋白结合率： F/P= ❖抗体效价：双向免疫扩散试验 ❖抗体特异性：吸收试验、抑制试验 ❖抗体抗体特异性染色滴度：倍比稀释 荧光抗体的制备 A nm A nm A 280 495 495nm 0.35 2.87 − 荧光抗体的鉴定
荧光抗体的制备 荧光抗体的保存 -20℃C:保存1~2年 真空干燥:长期保存
❖-20℃：保存1～2年 ❖真空干燥：长期保存 荧光抗体的制备 荧光抗体的保存