@奉山年单花 省级精品课程申报 定吸光度，敏感度最高。（见图2-2）。在吸收峰波长处测吸光度，波长变化影响 最小（如图2-2(a、b),A带）：而在其他波长处（如图2-2(a、b)B带），波长变 化对吸光度影响大，甚至测得浓度一吸光度曲线不呈直线。 12 图2-2 选择测定某一溶液所需的波长，是可以用不同的波长作该溶液的吸收光谱曲 线，从曲线上选择最适当的波长来进行这一溶液的测定工作，但是，在分析工 作中，尚有个别情况，不能单凭此一原则，而应根据下列三个原则，进行实际 试测，然后全面考虑利弊，再行选定。 1.应使被测溶液有适当的光密度，一般而言，适当的光密度为0.1-0.7， 而以0.2-0.6最理想。过低的光密度因仪器的读数误差而产生很大的相对误差 反之，过高的光密度则往往己超过直线范围而引入误差。 2.应使干扰影响降低至最低限度。在反应中，如遇不易去除的干扰色泽， 应选用对此干扰色泽最不灵敏的波长。 3.应使标准曲线在尽可能大的范围内接近直线。 在分光光度计上，单色光波长的选择原则一般是使被测溶液的单位浓度的吸 光度变化最大，同时还要具有最小的空白及干扰读数，借以获得最高的灵敏度 和正确性。最理想的办法是对每种物质的测定都应先测它的光谱吸收曲线及有 关干扰物的吸收曲线，根据这些光谱吸收曲线来选择最佳测定波长。表2-1可 供波长选择的参考。 (二)标准曲线的绘制 1.标准曲线的作用 (1)标准曲线又叫做校正曲线或工作曲线，它是比色分析法中不可缺少的步 骤。从浓度一光密度直线的直线特性，可以判断所采用方法的呈色反应是否符 合Lamben--Beer氏定律 (2)作多次平行测定绘制标准曲线，可判断在整个测定过程中操作、仪器等
@春山单花 省级精品课程申报 误差的大小，从而确定该测定方法的可靠性。 (3)从绘制标准曲线的斜率可以比较各种方法的灵敏度。 (4)当进行大批样品分析时，可省略多次计算，从光密度值直接查阅标准曲 线而求得被测物质的浓度。 2.标准曲线的作法 (1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓度选择一般应能包括 待测样品的可能变异最低与最高值，一般可选择5种浓度。浓度差距最好是成 倍增加或等级增加，并应与被测液同样条件下显色测定。 (②)标准液的测定：在比色时，读取光密度至少读2-3次，求其平均值，以 减少仪器不稳定而产生的误差。 (3)标准曲线图的绘制：一般常用的是光密度一浓度标准曲线。 ①用普通方格纸作图。图纸最好是正方形（长：宽=1：1）或长方形（长：宽 =3：2)，以横轴为浓度，纵轴为光密度，一般浓度的全距占用了多少格，光密 度的全距也应占用相同的格数。 在适当范围内配制各种不同浓度的标准液，求其光密度，绘制标准曲线， 以浓度位置向上延长，光密度位置向右延长、交点即为此座标标点。然后，将 各座标点和原点联成一条线，若符合Lambert-Beer氏定律，则系通过原点的直 线 ②若各点不在一直线，则可通过原点，尽可能使直线通过更多点，使不在 直线上的点尽量均匀地分布在直线的两边。 ③标准曲线绘制完毕以后，应在坐标纸上注明实验项目的名称，所使用标 准蛋白的种类与浓度，比色计的型号和仪器编号、单色光波长、比色杯内径以 及实验日期、制作人。 ④绘制标准曲线：一般应作二次或三次以上的平行测定，重复性良好曲线 方可应用。 ⑤绘制好的标准曲线只能供以后在相同条件下操作测定相同物质时使用。 当更换仪器、移动仪器位置、调换试剂及室温有明显改变时，标准曲线需重新 绘制。 ⑥标准曲线横坐标的标度：从标准液的含量换算成待测液的浓度。 (三)待测溶液浓度的计算
@泰山龙 省级精品课程申报 1.利用标准管法计算待测溶液的浓度 在同样实验条件下同时测得标准管和待测管的吸光度值，然后进行计算： 根据Lambert-beer定律： 标准管：A=KCL(下标S:标准液) 待测管：A=KCL(下标X:待测液) 两种溶液的液层厚度相等，温度相等，测定同一物质，所用单色光相同，则 两式相比得：As/ACs/C,即Cx=(As/A)·Cs 上式为实验操作中常用计算式。因比色皿本身和溶剂也会产生一定的光吸 收，故设置一个空白管，即其中除了待测溶质以外，其它的成分完全相同。以 空白管对准光路对仪器调零，消除非待测物的吸收，所测值即为待测物造成的 光吸收。 在实际操作中，有时需要求待测液的含量，为计算简便，常使待测管体积与 标准管体积相等（以X代表测定管含量，S代表标准管含量）则： X=(As/Ax).S 2.利用标准曲线进行换算 先配制一系列己知不同浓度的标准溶液，按测定管同样方法处理显色，分别 读取各管光密度，以各管光密度为纵轴，各管浓度为横轴，在方格坐标纸上作 图得标准曲线，以测定管光密度从标准曲线上可求得测定物的浓度。 3.直接利用公式进行计算 如果已知摩尔消光系数k,则可直接利用公式进行计算求得物质的浓度 由A=eLC推出C=A/eL 此计算法常用于紫外吸收，如核苷酸溶液含量测定，如UTP在262nm具有最 大吸收峰，利用已知UTP在262nm时的摩尔吸光率e,读取待测UTP溶液吸光 度A,即可求出该UTP浓度。 二种以上被测物的混合液，也可利用不同e进行定量测定。例如a,b两 种物质在波长入，时，摩尔吸光率分别为ea:和eb:,在波长入：时摩尔吸光率 分别为￡a和eb2,a和b混合的溶液在入，时吸光度为A,在入z时的吸光度 为A(图2-3)，各自浓度分别为Ca和Cb,则
园秦山通学花 省级精品课程申报 Ay=ta Ca+eb:Cb A:=ta:Ca+eb:Cb 解上式，得a,b丙物浓度 龄赋 图2-}b二成分潭台流的吸收光请 如有三种以上 成分的混合液，也可通过三种不同波长情况下的吸光度，以各自特有的ε值， 依据三元一次方程，同样可求出未分离的三种混合物的各自浓度 三、物质的定性分析 以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度，然后以入射光的 不同波长为横轴，各相应的吸光度为纵轴作图，可得到溶液的吸收光谱曲线。 吸收光谱曲线是物质的特征性曲线，它和分子结构有严格的对应关系故可作为 定性分析的依据。不同的物质，分子结构不同，其吸收光谱曲线也有其特殊形 状（图2-4）。 0.15 01004095060 长(am 图2-4维生素B水溶液的吸收光活 在吸收光谱中，往往可以找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大 吸收波长（入max)。物质不同，它们的波长(nm)最大吸收波长也往往不同，图 2-4为维生素B2溶液的吸收光谱曲线。 物质用分光分析定性主要依据吸收光谱存在的特征吸收。 1.比较吸收光谱曲线，在相同情况下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化 学结构不同，因为不同的物质有各自的特征性曲线。如ATP和GTP都属于核苷 酸，它们的溶液在紫外光区均有吸收，但由于化学结构不很一样，它们的吸收 光谱就有差别。需要注意的是在不同条件（如选择不同溶剂）下，即使是同一物
本山车花 省级精品课程申报 质也可呈现不同的吸收光谱。 2.比较最大的吸收波长。不同的物质可有不同的最大吸收波长(kmax)。如 ATP、GTP、CTP和UTP的入max分别为259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax 可作为物质定量测定的最适波长，此时测定灵敏度最高。有些物质化学结构相 近，可产生相同的入max,但它们的吸收系数都不一致，可据此鉴别之。 3.比较吸光度比值。可根据物质两个或几个不同波长的吸光度比值来鉴别 不同的物质，同时也可检查物质的纯度。如DNA溶液kmax为260nm。在260nm 的吸收度和在280m的吸收度比值为1.8。但溶液中混进了蛋白质，则比值会降 低（蛋白质在280nm处有最大吸收）， 四、常用分光光度计及使用介绍 【分光光度计的结构】 分光光度计的种类很多，其基本原理及结构基本相似， 一般都包括下列几个部 件，如下图所示。 光源 单色器 吸收池 →受光器→测量器 检测系统 狭缝 1.光源 一个良好的光源要求具备发光强度高、光亮、稳定、光谱范围较宽和使用寿命 长等特点。 分光光度计上常用的光源有钨灯和氢灯（或氘灯），前者适用于340~900m范围 的光源，后者适宜于200~一360m的紫外光区，为了使发出的光线稳定，光源的 供电需要由稳压电源供给。 2.单色器 单色器是将混合光波分解为单一波长光的装置，多用棱镜或光栅作为色散元件， 它们能在较宽光谱范围内分离出相对纯波长的光线，通过此色散系统可根据需 要选择一定波长范围的单色光，单色光的波长范围愈狭，仪器的敏感性愈高， 测量的结果愈可靠 3.狭缝