@春山单花 省级精品课程申报 ②在小烧杯中加入已知H值的标准缓冲溶液，将电极浸入，应使玻璃电极 的球状体和甘汞电极的毛细孔完全浸入溶液。再轻轻摇动烧杯，使电极所接触 的溶液均匀。 ③调节温度补偿器使旋钮指示的温度与杯内溶液（或室温）的温度相同。 ④根据标准缓冲液的pH值，将量程选择开关拨至0一7或7一14(pHS一2型 酸度计为分档开关)。 ⑤旋转零点调节器，使指针指在p7处。 ⑥按下读数开关，转动定位调节器，使指针恰好指在标准缓冲液的H处。 ⑦放开读数开关，指针应指在p7处，如有变动，则重复⑤、⑥操作至数值 稳定为止。 ⑧为了更好的校准，可分别采用两种p范围(0一7或7一14)的已知pH的 缓冲液进行校正。 ⑨校正完毕，用蒸馏水冲洗电极与烧杯。校正后，切勿再旋转定位调节器， 否则必须重新校正。 (3)测量 ①用滤纸轻轻触及两个电极以吸干剩余的溶液，或用待测液洗电极。然后， 将电极浸入盛有待测液的烧杯中，轻轻摇动烧杯使溶液均匀。 ②被测溶液的温度应与标准缓冲液的温度相同。 ③按下读数开关，指针所指的pH值即为待测液的值(pS一2型酸度计所测 读数应为分挡开关上的指示数加表头上指示值)。重复几次，直至数值不变为准。 ④在放开读数开关后，指针必须指在pH7处，否则，应旋转零位调节器至 pH7处以后，重测待测液的H值。 ⑤若在量程0一7范围测量时，指针读数超出刻度范围，应将量程开关拨至 到7一14的位置，再重复③、④的操作。 ⑥测量完放开读数开关，关闭电源开关。然后冲洗干净，玻璃电极可浸泡再 蒸馏水中，而将甘汞电极离开蒸馏水并戴上橡皮帽
國秦山年单花 省级精品课程申报 2.注意事项 ①玻璃电极在初次使用前，必须在蒸馏水中浸泡数日至一星期，至少泡 昼夜。平时，应经常浸泡在蒸馏水中，以备随时可用。 ②玻璃电极不要与强烈吸水的溶剂接触太久。在强碱溶液中使用应尽快操 作，用毕立即用水洗净。 ③玻璃电极球泡的玻璃膜很薄，因此勿与玻璃杯与硬物相碰，防止球泡破 碎。一般安装时甘汞电极头应长出球泡头部，使在摇动时不会碰到杯底。 ④玻璃电极的玻璃膜不要沾上油污。若不慎沾上油污应先用酒精再用四氯 化碳或乙醚，最后用酒精浸洗，再用水洗净。洗净后只能用滤纸轻轻吸干，千 万不要揩擦，以免破碎玻璃膜。 ⑤甘汞电极在使用时，要注意电极内充满氯化加钾溶液，里面应无气泡，防 止断路。并且要用少许氯化钾结晶存在，以使溶液保持饱和状态。在使用时应 将该电极上部的小橡皮塞拔去，让极少量的氯化钾溶液从毛细管中流出，使测 定结果可靠。 ⑥首次使用时，应检查电源是否与仪器要求相符。仪器的电源必须要有地 线，以使指针稳定。 3.标准缓冲液的配制 酸度计用的标准缓冲液要求：有较大的稳定，较小的温度依赖性其试剂易于 提纯。常用标准缓冲液的配制方法如下： 附表不同温度时标准缓冲液的pH值 酸性酒石酸0.05M0.025M0.0087K2 温 邻苯二KHPO: 0.01M 度 (25℃时饱甲酸氢0.025MNa0.0302M Na.B.O, ℃ 和) 钾HPO NaHPO 0 4.01 6.98 7.53 9.46 10 4.00 6.92 7.47 9.33 15 4.00 6.90 7.45 9.27
秦山学花 省级精品课程申报 20 4.00 6.88 7.43 9.23 26 3.56 4.01 6.80 7.41 9.18 30 3.55 4.02 6.85 7.40 9.14 38 3.55 4.03 6.84 7.38 9.08 40 3.55 4.01 6.84 7.38 9.07 503.55 4.06 6.83 7.37 9.01 将标准缓冲液储于硬质玻璃瓶或塑料瓶中，能稳定1一2月，它们的p川值随 温度不同稍有差异，见附表。 (1)pH=4.00(10℃-20℃) 将邻苯二甲酸氢钾在105℃干燥1小时后，称取5.07克加重蒸馏水溶解至 500毫升。 (2)pH=6.88(20℃) 称取在130℃干燥2小时的3.401克磷酸二氢钾(KHP0),8.95克磷酸氢二 钠(NaP0,·12H0)或3.549克无水磷酸氢二钠(NaHP0),加重蒸馏水溶解至 500毫升。 (3)p=9.18(25℃) 称取3.8144克四硼酸钠(NaB.0,·10H0)或2.20克无水四硼酸钠(NaB.0), 加重蒸馏水溶解至100毫升。 (张媛英，王泽平) 第二章分光光度技术 分光光度法是利用物质特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的一项技 术，该技术灵敏度强，精确度高，操作简便，快速：对于复杂的组分系统，勿 需分离即可检测出其中的微量组分，因此分光光度法已成为生物化学研究中广 泛使用的方法。 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400760nm,波长范围在200~ 400nm为紫外光区（波长<400nm的光线），波长范围在760~500000nm为红外区 (波长>760m…)。可见光区的电磁波，因波长不同而呈现不同的颜色，这些 不同颜色的电磁波称单色光，单色光并非单一波长的光，而是一定波长范围内
國秦山年草花 省级精品课程申报 的光，太阳及钨丝灯发出的白光，是各种单色光的混合光（复合光），利用棱镜 可将白光分成按波长顺序排列的各种单色光，即红、橙、黄、绿、青、蓝、紫 等，这就是光谱。 图2-1光线通过溶液介质示意图 一、基本原理 有色物质的显色，是由于它对光线的吸收具有选择性。白光是波长在 400-750m的电磁波，它是由各种波长不同，颜色不同：如果溶液对某些波长的 光吸收较少而对其它波长的光吸收较多，则溶液呈现这种吸收较少而透过较多 的光的颜色，例如溶液吸收了红光，透过蓝绿色光较多，则溶液呈现绿色。当 然一些物质的最大吸收波长在可见光波长以外，如蛋白质的吸收波长为280m, 核酸的最大吸收波长为260m。当光线通过透明介质时，某波长的光有一部分被 吸收，一部分透过，因此当光透射出溶液之后，光强度减少。Lambert-Beer定律是 利用分光光度计进行比色分析的基本原理，这个定律是讨论有色溶液对单色光 的吸收程度与溶液的浓度及液层厚度间的定量关系。 1.朗伯(Lambert)定律：当单色光通过一吸收光的介质时，其光强度随 吸收光介质的厚度增长而呈指数减少，即 I/I。=e*(k为吸光系数(absorption coefficient)(g·cm)) (I:入射光强度：I:透射光强度：L:介质的厚度) 2.比尔(Beer)定律：单色光通过一光吸收介质时，光强度随介质浓度增 长而呈指数减少。即 I/I。=e* (C为溶液浓度(Concentration)(g·L)) 两者结合在一起为朗伯-比尔(Lambert--Beer)定律。即 I/I。=eea
国春花 省级精品课程申报 式中e(epsilon)称之摩尔吸光率(Molar absorptivity))(亿·mol'·cm)系 常数，也叫消光系数：透光度T(Transmittance)为I/I,通常以百分率表示。 取对数：-1ogT=-1ogI/L。=-1ogea 令A=-1ogT 得：A=eCL式为lambert-Beer定律的物理表示式，其含义为一束 单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成 正比。此式为分光分析法的基本计算式。 式中A(Absorbance)为吸光度，C(concentration).浓度(mol/L),L为溶 液样品的长度cm(或比色皿内径长cm)。 采用适当的光源、棱镜和适当的光源接收器，让某一波长的光透过某一溶液， 通过仪器的测定，定性鉴别物质或定量测定某一组分含量的方法即为分光光度 法。通过光波长的调整，可使溶质浓度的测定范围不仅仅局限于可见光，尚可 扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽然不是纯的单色 光，但波长范围更狭窄，更符合Lambert-Beer定律，其灵敏度大为提高。 二、分光光度法的定量分析 许多对光有吸收的物质可以直接用分光光度法进行定量分析：一些对光，包 括紫外、可见或近红外都无吸收的物质亦可通过和某些化学试剂作用而呈色， 在一定的反应条件下和一定的浓度范围内，溶液颜色的深浅（对光吸收的程度） 和该溶液中显色物质的浓度呈正比。 (一)测定波长的选择 表2-1测定波长的选择 待测溶液颜 选用分光波长范围(nm) 待测溶液颜 选用分光波长范围(nm) 色 色 绿 400~420 紫青 540560 绿带黄 430440 蓝 570~600 黄 440~450 蓝带绿 600630 橙红 450~480 绿带蓝 630-760 红 490-530 波长的选择一般是选择待测物质最大吸收峰的波长（入max)。因在入max测