宿主通过粪便中的microRNA塑造肠道菌群 一、导读 宿主肠道拥有复杂的微生物群，其初始源自母代（体），并通 过摄食及与其他环境因素的接触而继续发展。人类幼儿在大约3岁 时，其肠道菌群会渐趋于成人的菌群组成特点，变得相当稳定。许 多因素都会影响肠道菌群，诸如宿主的遗传，饮食及病理状态等。 同一物种其菌群组成趋于相同，但不同物种间菌群大相径庭。在交 互肠道菌群移植实验中，移植后的无菌斑马鱼及无菌小鼠的肠道菌 群与其同类更为相似，这表明宿主拥有让特定菌群选择性定殖的机 制。因为肠道菌群在宿主的代谢、免疫及疾病中都扮演重要角色， 故阐明宿主调控菌群的机制与方式显得尤为重要。 miRNA是一类小的非编码RNA,大约长度为18-23nt,在细胞 核中合成，细胞质中发挥功能。然而，越来越多的证据表明miRNA 也出现在胞外并随体液而流动散播。先前的研究已经发现粪便中的 miRNA可以作为肠道肿瘤的分子标志物。但正常的肠道中是否拥有 miRNA还未探明。本文在肠内容物及粪便中发现miRNA,并且阐 明其在调控宿主菌群的角色。 二、论文 原名：The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA 译名：宿主通过粪便中的microRNA塑造肠道菌群 期T刊：Cell Host&Microbe IF:14.946 发表时间：2016年1月
宿主通过粪便中的 microRNA 塑造肠道菌群 一、导读 宿主肠道拥有复杂的微生物群，其初始源自母代（体），并通 过摄食及与其他环境因素的接触而继续发展。人类幼儿在大约 3 岁 时，其肠道菌群会渐趋于成人的菌群组成特点，变得相当稳定。许 多因素都会影响肠道菌群，诸如宿主的遗传，饮食及病理状态等。 同一物种其菌群组成趋于相同，但不同物种间菌群大相径庭。在交 互肠道菌群移植实验中，移植后的无菌斑马鱼及无菌小鼠的肠道菌 群与其同类更为相似，这表明宿主拥有让特定菌群选择性定殖的机 制。因为肠道菌群在宿主的代谢、免疫及疾病中都扮演重要角色， 故阐明宿主调控菌群的机制与方式显得尤为重要。 miRNA 是一类小的非编码 RNA，大约长度为 18-23nt，在细胞 核中合成，细胞质中发挥功能。然而，越来越多的证据表明 miRNA 也出现在胞外并随体液而流动散播。先前的研究已经发现粪便中的 miRNA 可以作为肠道肿瘤的分子标志物。但正常的肠道中是否拥有 miRNA 还未探明。本文在肠内容物及粪便中发现 miRNA，并且阐 明其在调控宿主菌群的角色。 二、论文 原名：The Host Shapes the Gut Microbiota via Fecal MicroRNA 译名：宿主通过粪便中的 microRNA 塑造肠道菌群 期刊：Cell Host＆Microbe IF：14.946 发表时间：2016 年 1 月
通讯作者：Howard L.Weiner 通讯作者单位：哈佛医学院(Harvard Medical School) 三、试验设计 nirna来自哪里？ 小鼠与人的英便中存在 我到源头后才能对美便中的mRNA来源 miRNA miRNA进行操作 于IEC及HOPX+细胞 miRNA与菌群共同存在粪便中，两者之间可能会有联系 (interactions) DIRNA块失使小： 鼠肠道菌群素乱 ↓ Why 体外(in vitro)试验表明 How 调控机制：进入细菌，进行与 miRNA可以影响菌的生长 核酸序列相关的调拉 体内(miO)试验表明移植正常小鼠miRNA 给产miRNA缺格的小，使后者菌群恢复正常 miRNA可以操控菌群，实战是否奏效？ 仅移植野生小鼠miRNA而不包括菌群给结肠炎小鼠，能够 改善结肠炎症状 四、结果 l.鉴别(identification)人及小鼠粪便中的miRNA 由于正常肠道中是否拥有miRNA并未报道过，于是作者尝试分 离、鉴定正常肠道中的miRNA。在分离得到粪便中的miRNA后， 作者进行了系列分析。图1中的A、B,作者统计了人与小鼠粪便中 丰度前50的miRNA,且图1C中韦恩图表明人与小鼠有17种共同
通讯作者：Howard L. Weiner 通讯作者单位：哈佛医学院（Harvard Medical School） 三、试验设计 四、结果 1.鉴别（identification）人及小鼠粪便中的 miRNA 由于正常肠道中是否拥有 miRNA 并未报道过，于是作者尝试分 离、鉴定正常肠道中的 miRNA。在分离得到粪便中的 miRNA 后， 作者进行了系列分析。图 1 中的 A、B，作者统计了人与小鼠粪便中 丰度前 50 的 miRNA，且图 1C 中韦恩图表明人与小鼠有 17 种共同
种类miRNA。肠腔不同部位中的miRNA丰度有所不同，结肠比回 肠的丰度更高，这与菌群分布正好相反，回肠中的菌群丰度较结肠 更高（图1D)。为了确定肠道中菌群对粪便中的miRNA是否有影 响，作者又比较了同为一窝的无菌小鼠(GF)与无特定病原菌小鼠 (SPF)的粪便miRNA,发现无菌小鼠粪便中的miRNA丰度更高， 且两组小鼠粪便中的miRNA组成上也不相同（图1E)。为了进一 步验证菌群与miRNA的丰度是否是一种相关关系，作者又比较了 SPF小鼠与抗生素处理小鼠的粪便miRNA组成，发现通过抗生素处 理清除肠道菌的小组其拥有更多的miRNA(图IF)。 A名1 ouse Humar Mouse 33 Human
种类 miRNA。肠腔不同部位中的 miRNA 丰度有所不同，结肠比回 肠的丰度更高，这与菌群分布正好相反，回肠中的菌群丰度较结肠 更高（图 1D）。为了确定肠道中菌群对粪便中的 miRNA 是否有影 响，作者又比较了同为一窝的无菌小鼠（GF）与无特定病原菌小鼠 （SPF）的粪便 miRNA，发现无菌小鼠粪便中的 miRNA 丰度更高， 且两组小鼠粪便中的 miRNA 组成上也不相同（图 1E）。为了进一 步验证菌群与 miRNA 的丰度是否是一种相关关系，作者又比较了 SPF 小鼠与抗生素处理小鼠的粪便 miRNA 组成，发现通过抗生素处 理清除肠道菌的小组其拥有更多的 miRNA（图 1F）
D E lleal vs Colonic content GF vs Colonized feces ABX vs SPF Colonic content 10 2 Log2 [Fo 图I鉴别(identification)粪便及肠腔内容物中的miRNA 注：D-F上侧为火山图，统计差异及差异显著性。横轴为L0g2 (X/X数量的倍数)，纵轴为P值。图中小点表示某一种miRNA: 下侧为PCA分析，分析组成的相似性或差异性。 2.肠上皮细胞及表达Hopx阳性细胞是miRNA的两大主要来源 粪便中mRNA的来源先前未被报道过，因为有研究表明肠上皮 细胞(IECs)分泌外泌体(exosome),而作者发现miRNA存在于 外泌体中，他们就设计实验来验证miRNA是否源自ECs。Dicer酶 是在miRNA成熟过程中的必须酶，它参与miRNA的剪切。故作者 培育了IECs细胞无Dicer酶表达的小鼠(Dicer1△IEC),与IECs细 胞表达Dicer酶的小鼠(Dicer1fl/H)并比较两组小鼠粪便中的 miRNA的丰度，图2A中火山图表明IECs细胞无Dicer酶的小鼠， 其粪便中的miRNA减少了，所以可以得出IECs是miRNA的来源。 同样的方法，发现Hopx表达阳性细胞也是miRNA的来源（图 2B)。且在两种无Dicer酶的细胞中miRNA变化是不同的，故 Hopx+细胞与ECs负责产生不同的miRNA。同时作者又用另一种方
图 1 鉴别（identification）粪便及肠腔内容物中的 miRNA 注：D-F 上侧为火山图，统计差异及差异显著性。横轴为 Log2 （X/X 数量的倍数），纵轴为 P 值。图中小点表示某一种 miRNA； 下侧为 PCA 分析，分析组成的相似性或差异性。 2.肠上皮细胞及表达 Hopx 阳性细胞是 miRNA 的两大主要来源 粪便中 miRNA 的来源先前未被报道过，因为有研究表明肠上皮 细胞（IECs）分泌外泌体（exosome），而作者发现 miRNA 存在于 外泌体中，他们就设计实验来验证 miRNA 是否源自 IECs。Dicer 酶 是在 miRNA 成熟过程中的必须酶，它参与 miRNA 的剪切。故作者 培育了 IECs 细胞无 Dicer 酶表达的小鼠（Dicer1∆IEC），与 IECs 细 胞表达 Dicer 酶的小鼠（Dicer1fl/fl）并比较两组小鼠粪便中的 miRNA 的丰度，图 2A 中火山图表明 IECs 细胞无 Dicer 酶的小鼠， 其粪便中的 miRNA 减少了，所以可以得出 IECs 是 miRNA 的来源。 同样的方法，发现 Hopx 表达阳性细胞也是 miRNA 的来源（图 2B）。且在两种无 Dicer 酶的细胞中 miRNA 变化是不同的，故 Hopx+细胞与 IECs 负责产生不同的 miRNA。同时作者又用另一种方
法去验证上述结论，即通过葡聚糖硫酸钠(DSS)处理小鼠诱导其 得结肠炎(colitis),从而破坏其肠上皮细胞且使Hopx+细胞之一 杯状细胞(globlet cells)丢失，用该种小鼠与未处理(naive)小鼠 对比，发现前者粪便中的mRNA减少了，进一步说明粪便中的 miRNA来源于肠上皮细胞。至此，细心的读者会质疑：粪便中的 miRNA是由上皮细胞分泌进入粪便中的？还是粪便中的miRNA分 离自脱落的上皮细胞本身呢？作者继续比较了上皮细胞与肠内容物 中miRNA的组成，发现有很多miRNA是两者共有的，但肠内容物 中许多种miRNA的丰度比上皮细胞高得多，这说明两者是有区别的， 故排除粪便中的miRNA是分离自脱落的上皮细胞一说，印证粪便中 的miRNA是上皮细胞分泌而来的。 另外作者还考虑淋巴细胞是不是粪便中miRNA的来源，于是其 设计了实验进行检测。Rgl基因被敲除的小鼠不能形成淋巴B、T 细胞，故作者构建了Ragl-与野生型型小鼠(WT进行比较，发现两 者粪便中的miRNA相差不大（图2D),故淋巴细胞不是粪便中 miRNA的来源。 Log2 IFold change(/Dicer1) Log2 [Fold change (Dicer1/Dicer1) 图2肠上皮细胞(IECs)和表达Hopx细胞是粪便中miRNA的 主要来源
法去验证上述结论，即通过葡聚糖硫酸钠（DSS）处理小鼠诱导其 得结肠炎(colitis)，从而破坏其肠上皮细胞且使 Hopx+细胞之一—— 杯状细胞（globlet cells）丢失，用该种小鼠与未处理（naive）小鼠 对比，发现前者粪便中的 miRNA 减少了，进一步说明粪便中的 miRNA 来源于肠上皮细胞。至此，细心的读者会质疑：粪便中的 miRNA 是由上皮细胞分泌进入粪便中的？还是粪便中的 miRNA 分 离自脱落的上皮细胞本身呢？作者继续比较了上皮细胞与肠内容物 中 miRNA 的组成，发现有很多 miRNA 是两者共有的，但肠内容物 中许多种 miRNA 的丰度比上皮细胞高得多，这说明两者是有区别的， 故排除粪便中的 miRNA 是分离自脱落的上皮细胞一说，印证粪便中 的 miRNA 是上皮细胞分泌而来的。 另外作者还考虑淋巴细胞是不是粪便中 miRNA 的来源，于是其 设计了实验进行检测。Rag1 基因被敲除的小鼠不能形成淋巴 B、T 细胞，故作者构建了 Rag1-/-与野生型型小鼠(WT)进行比较,发现两 者粪便中的 miRNA 相差不大（图 2D），故淋巴细胞不是粪便中 miRNA 的来源。 图 2 肠上皮细胞（IECs）和表达 Hopx 细胞是粪便中 miRNA 的 主要来源