常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。 根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操 作不当均会产生“试验无效“的后果。 b.标本/阴性对照比值 在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本(S)和阴性对 照(N)的A值后，计算S/N值.也有写作P/N的，这里的P不代表阳性(positive),而是病人(patient) 的缩写，不应误解。为避免混酒，更宜用S/N表示。在早期的间接法LIS中，有些作者定出S/N 为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的S小的阀值。更 应注意的是，N所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋 白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此， 这类试剂盒规，如N<0.05(或其他数值)，则按0.05计算，否则将出现假阳性结果。 (2)竞争法 在竞争法LISA中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中醇结合物的浓度和加入 竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在1.0-1.5之间，此时反应最为敏感 竞争法LISA不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用 比色计测定，读出S、P和N的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。 a。阳性判定值法 与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照A值，现举某种检测 抗Bc的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗Bc的复钙人血浆，阳性对照中抗Bc含量为 125士100u/ml。每次试验设2个阳性对照和3个阴性对照。测得A值后，先计算阴性对照A值的平 均值(CX)和阳性对照A值的平均数(PCX),两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值（例 如0.300)，试验才有效。3个阴性对照A值均应小于2.000，而且应≥0.5×NCX并≤1.5×CX,如 其中之一超出此范围，则弃去，而以另2个阴性对照重新计算×NCX:如有2个阴性对照A超出以上 范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阴性判定值=0.4XNCX+0.6×PCX 标本A值≤阳性判定值的反应为阳性，A>阳性判定值的反应为阴性。 b.抑制率法 抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算： 抑制率(%)=（阴性对照A值-标本A值）X100%/阴性对照A值 一般规定抑制率≥50%为阳性，<50%为阴性
常数，只适合于该特定条件下，而不是对各种试剂均可通用。 根据以上叙述可以看出，在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用，试剂变质和操 作不当均会产生"试验无效"的后果。 b.标本/阴性对照比值 在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S）和阴性对 照（N）的 A 值后，计算 S/N 值。也有写作 P/N 的，这里的 P 不代表阳性(positive)，而是病人（patient） 的缩写，不应误解。为避免混淆，更宜用 S/N 表示。在早期的间接法 ELISA 中，有些作者定出 S/N 为阳性标准，现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的 S/N 的阈值。更 应注意的是，N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋 白质或蛋白质含量较底的缓冲液，以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此， 这类试剂盒规，如 N<0.05（或其他数值），则按 0.05 计算，否则将出现假阳性结果。 （2）竞争法 在竞争法 ELISA 中，阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入 竞争抑制物的量，一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5 之间，此时反应最为敏感。 竞争法 ELISA 不易用自视判断结果，因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用 比色计测定，读出 S、P 和 N 的吸光值。计算方法主要也有两种，即阳性判定值法和抑制率法。 a. 阳性判定值法 与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同，但在计算公式中引入阳性对照 A 值，现举某种检测 抗 HBc 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗 HBc 的复钙人血浆，阳性对照中抗 HBc 含量为 125±100u/ml。每次试验设 2 个阳性对照和 3 个阴性对照。测得 A 值后，先计算阴性对照 A 值的平 均值（NCX）和阳性对照 A 值的平均数（PCX），两个平均数的差（N-P）必须大于一个特定的数值（例 如 0.300）,试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应小于 2.000，而且应≥0.5×NCX 并≤1.5×NCX，如 其中之一超出此范围，则弃去，而以另 2 个阴性对照重新计算×NCX；如有 2 个阴性对照 A 超出以上 范围，则该次实验无效。阳性判定值按下式计算： 阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX 标本 A 值≤阳性判定值的反应为阳性，A＞阳性判定值的反应为阴性。 b. 抑制率法 抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度，按下式计算： 抑制率（%）= （阴性对照 A 值-标本 A 值）×100%/阴性对照 A 值 一般规定抑制率≥50%为阳性，＜50%为阴性
4.7.2定量测定 ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此 在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定 大分子量物质的夹心法LISA,标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近2.0，绘制时 常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线 一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。甲胎蛋白质LISA 测定的标准曲线示例见图4-1。 测定小分子量物质常用竞争法（参见2.2），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准 曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。L,ISA测定的标准曲线示例见图4-2。注意图中横 坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达 生物谷讲座2：LISA技术中的抗原与抗体的反应 抗体 1.2.1抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五类，即Ig心、IgA、IgM、IgD 和1gE。与免疫测定有关的Ig主要为1sG和IgW。1g由两个轻链(L)和两个重链(H)的单体组成 Ig的轻链是相同的，有x(kappa)和入(Lambda)两种型别。五类Ig的重链结构不同，这决定 了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为Y(gama)链和μ(mu)链。IgG的结构见图。 ①木瓜酶裂解部位②胃蛋白酶裂解部位 重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用州和儿表示。两者构 成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合 抗原的结构基础， IgG可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段(Fb)。每个Fab都保 存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一 区段称Fc段，无抗体活性，但具有IgG特有的抗原性。 IgG可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个Fab双体，称F(ab')2,能和两个相同的抗原结合：另 片段类似FC,随后被分解成小分子多肽，无生物活性。 Ig是由五个单体组成的五聚体，含10个重链和10个轻链，具有10个抗原结合价，由于空间位置 的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM分子量约为900000，IgG分子量约为150000
4.7.2 定量测定 ELSIA 操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此 在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。测定 大分子量物质的夹心法 ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线最高点的吸光度可接近 2.0，绘制时 常用半对数纸，以检测物的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，将各浓度的值逐点连接，所得曲线 一般呈 S 形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。甲胎蛋白质 ELISA 测定的标准曲线示例见图 4-1。 测定小分子量物质常用竞争法（参见 2.2），其标准曲线中吸光度与受检物质的浓度呈负相关。标准 曲线的形状因试剂盒所用模式的差别而略有不同。ELISA 测定的标准曲线示例见图 4-2。注意图中横 坐标为对数关系，这更有利于测定系统的表达 生物谷讲座 2：ELISA 技术中的抗原与抗体的反应 抗体 1.2.1 抗体的结构 抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig 分五类，即 IgG、IgA、IgM、IgD 和 IgE。与免疫测定有关的 Ig 主要为 IgG 和 IgM。Ig 由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。 Ig 的轻链是相同的，有 κ（kappa）和 λ（Lambda）两种型别。五类 Ig 的重链结构不同，这决定 了它们的抗原性也不同。IgG 和 IgM 的重链分别称为 γ（gamma）链和 μ（mu）链。IgG 的结构见图。 ① 木瓜酶裂解部位 ② 胃蛋白酶裂解部位 重链和轻链的 N 端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用 VH 和 VL 表示。两者构 成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合 抗原的结构基础。 IgG 可被木瓜蛋白酶分解为三个区段，其中两个相同的区段称抗原结合片段（Fab）。每个 Fab 都保 存结合抗原的能力，但只有一个抗原结合位点，是单价的，与抗原结合后不出现凝集或沉淀。另一 区段称 Fc 段，无抗体活性，但具有 IgG 特有的抗原性。 IgG 可被胃蛋白酶分解为两个片段，一个 Fab 双体，称 F（ab'）2，能和两个相同的抗原结合；另一 片段类似 Fc，随后被分解成小分子多肽，无生物活性。 IgM 是由五个单体组成的五聚体，含 10 个重链和 10 个轻链，具有 10 个抗原结合价，由于空间位置 的影响，只表现为五个抗原结合价。IgM 分子量约为 900000，IgG 分子量约为 150000
机体被微生物感染后，先产生【gM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体量逐渐减少 而消失，而1gG抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 IgM抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此IgM抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的 临床诊断价值。右图为为甲型肝炎病人血清中IgG抗体和IgM抗体出现的时间和水平 1.3抗原抗体反应 1.3.1可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力(affinity)是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数K表示： K=[Ag·Ab]/[Ag][Ab] Ag·A仙的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合， 两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法 来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的IgG抗体仅占总IgG中的极小部分。用亲和层析法提取 的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。 1.3.2最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图1-4。曲线的高蜂部分是抗 原抗体比例最合适的范围，称为等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带 和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象(zo phenomenon)。抗体过量称为前带(prezone),抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法 测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，其至出现假阴性。 1.3.3特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结 构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原 (BsAg)、e抗原(BeAg)和核心抗体(BcAg),随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合， 而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物 (例如血清)中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有者部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交 叉反应。例如：绒毛膜促性腺激素(hCG)和黄体生成激素(LH)均由a和B两个亚单位组成，其 结构的不同处在B亚单位，而两者的á亚单位是同类的。用hCG免疫动物所得的抗血清中含有抗
机体被微生物感染后，先产生 IgM 抗体，然后产生 IgG 抗体。经过一段时间，IgM 抗体量逐渐减少 而消失，而 IgG 抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 IgM 抗体一般为保护性抗体具有免疫性。因此 IgM 抗体的测定，对某些传染病如甲型肝炎有较高的 临床诊断价值。右图为为甲型肝炎病人血清中 IgG 抗体和 IgM 抗体出现的时间和水平。 1.3 抗原抗体反应 1.3.1 可逆性 抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为： Ag+Ab→Ag·Ab 抗体的亲和力（affinity）是抗原抗体间的固有结合力，可以用平衡常数 K 表示： K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab] Ag·Ab 的解离程度与 K 值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合， 两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法 来提纯抗原或抗体。在抗血清中，特异性的 IgG 抗体仅占总 IgG 中的极小部分。用亲和层析法提取 的特异性抗体，称为亲和层析纯抗体，应用于免疫测定中可得到更好的效果。 1.3.2 最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图 1-4。曲线的高峰部分是抗 原抗体比例最合适的范围，称为等价带（zone of equivalence）。在等价带前后分别为抗体过剩带 和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象（zone phenomenon）。抗体过量称为前带（prezone），抗原地过量称为后带（postzone）。在用免疫学方法 测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。 1.3.3 特异性 抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结 构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。例如乙肝病毒中的表面抗原 （HBsAg）、e 抗原（HBeAg）和核心抗体（HBcAg），随来源于同一病毒，但仅与其相应的抗体结合， 而不与另外两种抗体反应。抗原抗体反应的这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物 （例如血清）中测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。 但是这种特异性也不是绝对的。假使两种化合物有着部分相同的结构，在抗原抗体反应中可出现交 叉反应。例如：绒毛膜促性腺激素（hCG）和黄体生成激素（LH）均由 α 和 β 两个亚单位组成，其 结构的不同处在 β 亚单位，而两者的 α 亚单位是同类的。用 hCG 免疫动物所得的抗血清中含有抗