实验三索氏提取法测定水果粗脂肪含量 、原理： 许多热带水果都富含脂肪，尤其油梨最为突出，在加利福尼亚曾把油梨的含油量作为它 成熟的标准。 脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂，如乙醚石油醚等，因此常用油重法测粗脂肪含量。 一仪 1、索氏脂肪提取器 2、电热恒温水浴锅 3、滤纸 三、试剂：无水乙醚 四、材料：油梨或其他植物油质果实 方法步骤： 1、将洗净的索氏抽提器小烧瓶，置于105℃烘箱中烘2小时，取出置干燥器中冷却 用分析天平称重，记录W2。 2、样品制备：支油梨表层绿皮，沿果实半径方向切取材料，称取果肉50g,用刀片切 碎，装入滤纸袋，将滤纸袋放入提取管内。 3、己称重的小烧瓶内，倒入23体积的无水乙醚，联接索氏提取器各部分，在水浴锅 上进行抽提，控 制水浴温度 以每小时回馏3 5次为宜 一般提24小时 4、抽提完毕，待乙酰完全流入小烧瓶时，取出滤纸袋，再回馏一次以洗涤抽提管。然 后必为蒸馏装置回收乙醚，直至小烧瓶中乙醚基本蒸尽，取下小烧瓶。 5、将装有脂肪的小烧瓶置于105℃烘箱中烘1小时，取出置于干燥器内冷却称重：再 烘半小时，再称重，直至恒重，记下W,便可计算脂肪含量： 粗脂肪%= W-W2一x100 A W1一一烧瓶重+脂肪重：W2一一烧瓶重：A一一样品重 六、注意事项： 1、乙醚易挥发有毒，使用时注意实验室通风条件 2、取材料时沿半径方向切下，是因为油梨果实各层果肉脂肪含量不同 参考文献 1.上海植生所.植物生理学手册
5 实验三 索氏提取法测定水果粗脂肪含量 一、 原理： 许多热带水果都富含脂肪，尤其油梨最为突出，在加利福尼亚曾把油梨的含油量作为它 成熟的标准。 脂肪不溶于水，易溶于有机溶剂，如乙醚石油醚等，因此常用油重法测粗脂肪含量。 二、 仪器： 1、 索氏脂肪提取器 2、 电热恒温水浴锅 3、 滤纸 三、 试剂：无水乙醚 四、 材料：油梨或其他植物油质果实 五、 方法步骤： 1、 将洗净的索氏抽提器小烧瓶，置于 105℃烘箱中烘 2 小时，取出置干燥器中冷却， 用分析天平称重，记录 W2。 2、 样品制备：支油梨表层绿皮，沿果实半径方向切取材料，称取果肉 50g，用刀片切 碎，装入滤纸袋，将滤纸袋放入提取管内。 3、 已称重的小烧瓶内，倒入 2/3 体积的无水乙醚，联接索氏提取器各部分，在水浴锅 上进行抽提，控制水浴温度，以每小时回馏 3~5 次为宜，一般提 24 小时。 4、 抽提完毕，待乙醚完全流入小烧瓶时，取出滤纸袋，再回馏一次以洗涤抽提管。然 后必为蒸馏装置回收乙醚，直至小烧瓶中乙醚基本蒸尽，取下小烧瓶。 5、 将装有脂肪的小烧瓶置于 105℃烘箱中烘 1 小时，取出置于干燥器内冷却称重；再 烘半小时，再称重，直至恒重，记下 W1，便可计算脂肪含量： 粗脂肪％= W1- W2 ×100 A W1——烧瓶重+脂肪重； W2——烧瓶重； A——样品重 六、 注意事项： 1、 乙醚易挥发有毒，使用时注意实验室通风条件 2、 取材料时沿半径方向切下，是因为油梨果实各层果肉脂肪含量不同 参考文献 1. 上海植生所. 植物生理学手册
实验四维生素C含量测定 一、原理： 维生素C,也称抗坏血酸，属水溶性维生素，具有很强的还原性。在碱性溶液中加热并 有氧化剂存在时，易被氧化破坏在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将26 氯酚靛酚还 原成无色的还原型2.6 氯酚靛酚，自身被氧化成脱氢抗环血酸 氧化型的2.6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此，当 用2.6二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部氧化的情况下，滴 下的26-二氯酚靛酚立即被还原成无色的还原型2.6二氯酚靛酚。当滴定到溶液中的抗坏血 凳舍新氧化数再下的26一富酚款即使诺液现红色一所以。当故迪定的溶流出 容液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化、 此时即为滴定终点。便可 根据染料标准溶液的消耗量来计算维生素C含量。 CI 0 二、仪器 1、微量滴定管5ml: 2、三角瓶50ml6只 3、研体 4、漏斗 5、容量瓶50ml 6、移液管10ml 7、量筒10ml 三、试剂 1、1%草酸溶液 2、2%草酸溶液 3、0.0005molL2.6-二氯酚靛酚溶液：称取干燥过的2.6-二氯酚靛酚60mg,置于200ml 容量瓶中，加热蒸馏水100ml,滴加0.01mol/LNaOH4滴，强烈摇动数分钟，冷却后加蒸馏 水至刻度，摇匀后经紧密滤纸滤入棕色瓶中，贮于冰箱各用，有效期一周，每次使用前标定 、材料：热带水果 五 方法与步骤 1、称取4g新鲜材料，置研钵中，加5ml2%草酸，研成匀浆。将榈提取液转移至50ml 容量瓶中，残渣再用2%草酸提取3次并将提取液转入容量瓶，再加15ml2%草酸溶液至 容量瓶中最后用1%草酸定容。如果有泡沫，先加几滴乙醚消除泡沫后再定容。摇匀过滤 滤液各用 、吸取滤液10ml,置50ml三角瓶中， 立即用2.6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现粉红 色，粉红色在15秒内不消失为止，记录结果。 3、在另一50ml容量瓶内，放入35ml2%草酸，并用1%草酸定容，摇匀。取此溶液 10ml进行空白滴定。 6
6 实验四 维生素 C 含量测定 一、 原理： 维生素 C，也称抗坏血酸，属水溶性维生素，具有很强的还原性。在碱性溶液中加热并 有氧化剂存在时，易被氧化破坏；在中性和微酸性环境中，抗坏血酸能将 2.6-二氯酚靛酚还 原成无色的还原型 2.6-二氯酚靛酚，自身被氧化成脱氢抗坏血酸。 氧化型的 2.6-二氯酚靛酚在酸性溶液中呈红色，在中性或碱性溶液中呈蓝色。因此，当 用 2.6-二氯酚靛酚滴定含有抗坏血酸的酸性溶液时，在抗坏血酸尚未全部氧化的情况下，滴 下的 2.6-二氯酚靛酚立即被还原成无色的还原型 2.6-二氯酚靛酚。当滴定到溶液中的抗坏血 酸全部氧化时，则再滴下的 2.6-二氯酚靛酚立即使溶液呈现红色。所以，当被滴定的溶液由 无色转变成微红色时，即表明溶液中的抗坏血酸刚刚全部被氧化，此时即为滴定终点。便可 根据染料标准溶液的消耗量来计算维生素 C 含量。 CI O N OH O 二、 仪器 1、 微量滴定管 5ml； 2、 三角瓶 50ml 6 只 3、 研钵 4、 漏斗 5、 容量瓶 50ml 6、 移液管 10ml 7、 量筒 10ml 三、 试剂 1、 1％草酸溶液 2、 2％草酸溶液 3、 0.0005mol/L2.6-二氯酚靛酚溶液：称取干燥过的 2.6-二氯酚靛酚 60mg，置于 200ml 容量瓶中，加热蒸馏水 100ml，滴加 0.01mol/LNaOH 4 滴，强烈摇动数分钟，冷却后加蒸馏 水至刻度，摇匀后经紧密滤纸滤入棕色瓶中，贮于冰箱备用，有效期一周，每次使用前标定。 四、 材料：热带水果 五、 方法与步骤： 1、 称取 4g 新鲜材料，置研钵中，加 5ml 2％草酸，研成匀浆。将榈提取液转移至 50ml 容量瓶中，残渣再用 2％草酸提取 3 次并将提取液转入容量瓶，再加 15ml 2％草酸溶液至 容量瓶中最后用 1％草酸定容。如果有泡沫，先加几滴乙醚消除泡沫后再定容。摇匀过滤， 滤液备用。 2、 吸取滤液 10ml，置 50ml 三角瓶中，立即用 2.6-二氯酚靛酚钠溶液滴定至出现粉红 色，粉红色在 15 秒内不消失为止，记录结果。 3、 在另一 50ml 容量瓶内，放入 35ml 2％草酸，并用 1％草酸定容，摇匀。取此溶液 10ml 进行空白滴定
4、标定2.6.二氯酚靛钠溶液：称取维生素C20mg,用1%草酸溶解并定容至200ml,吸 取10ml用1%草酸稀释到20ml吸取此液10ml于三角瓶中，立即用特标定的26.二氯酚 靛酚钠滴至终点，同时用10ml1%草酸在另一三角瓶中作空白滴定，按下式计算K值 K= 200 K一一1m2.6二氯酚靛酚钠溶液所能氧化抗坏血酸的毫克数 C一称取维生素C的毫克数 商定标准维生 ，与 滴定空白所用染料毫升数的差值 5、计算样品中维生素C含量 XmgV/100g样品)= (V-V2)×KxVX1o0 Va 一样品重 W一一样品重 V一一滴定样品所用染料毫升数 V一一滴定空白所用染料衰升数 V一一测定样品所取样品液章升数 一样品提取液总体积 1ml染料所能氧化V.毫克数 六、注意事项 1、操作要快，并避免与铜铁器接触，减少V,的氧化 2、样品提取液中常有色素类物质存在，给滴定终点的观察带来困难，当样品带色时， 可在测定前于提取液中2ml二氯乙烷，在滴定时，当二氯乙烷由无色变为粉红时 即为滴定终点。 参考文献 1.北京大学生物化学实验指导 2.西北农大植物生理学实验指导
7 4、 标定 2.6-二氯酚靛钠溶液：称取维生素 C20mg，用 1％草酸溶解并定容至 200ml，吸 取 10ml 用 1％草酸稀释到 200ml，吸取此液 10ml 于三角瓶中，立即用待标定的 2.6-二氯酚 靛酚钠滴至终点，同时用 10ml 1％草酸在另一三角瓶中作空白滴定，按下式计算 K 值： K= G × 10 × 10 200 200 V K——1ml2.6-二氯酚靛酚钠溶液所能氧化抗坏血酸的毫克数 C——称取维生素 C 的毫克数 V——滴定标准维生素 C 与滴定空白所用染料毫升数的差值 5、 计算样品中维生素 C 含量 X(mgVc/100g 样品)= （V13-V2）×K×V ×100 V3 X——样品重 W——样品重 V1——滴定样品所用染料毫升数 V2——滴定空白所用染料毫升数 V3——测定样品所取样品液毫升数 V——样品提取液总体积 K——1ml 染料所能氧化 Vc毫克数 六、 注意事项 1、 操作要快，并避免与铜铁器接触，减少 Vc的氧化 2、 样品提取液中常有色素类物质存在，给滴定终点的观察带来困难，当样品带色时， 可在测定前于提取液中 2ml 二氯乙烷，在滴定时，当二氯乙烷由无色变为粉红时， 即为滴定终点。 参考文献 1. 北京大学 生物化学实验指导 2. 西北农大 植物生理学实验指导
实验五多酚氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性测定 、原理 多酚氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶是与植物衰老生理密切相关的酶，也常用作为水 果贮藏过程中衰老程度的指标。 ()、名酚氧化酯：名酚氧化酶是一种以简单的铜离子作为铺基的酶，它能利用空气中 的氧将类儿萘酚氧化成褐色化合物 COH+0:多酚氧化辞一C《0 OH 0 爱人过氧化氢酶过氧化氢醇是一种以铁为辅基的醇。在催化过无 分子过氧化氢结合，生成具有活性的中间产物，这个中间产物能催化另一分子过氧 化氢分解生成水和氧分子。 E+H2O2+ +E一HO2 过氧化氢酶 活性物质 EH,0+E一HO E+2H,0+01 白、过氧化物酶：在过氧化氢存在时， 过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物 质： OCH;(OCH3)CH:(OCH3)O HO +4H,02 过氧化物酶 OCsH:(OCHs)CoH:(OCH)-O 二、仪器设备 1、匀浆机2、漏斗3、纱布4、离心机5、吸量管：5ml×4:1ml×4: 10ml×26、量筒200ml×17、抄表8分光光度计9、微量进样器50ml 三、药品 1、1molL磷酸(pH=6.5)缓冲液：称取9.45gNaH,PO42H,0用蒸馏水溶解，定量转入 2000ml容量瓶中：再称取845 g NazHPO.47H.0(或11.3 g Na:HPO4.12HO)用蒸馏水溶解定 量转入同一容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度，摇匀。 2、0.05mol/L磷酸(pH=6.5)缓冲液：取0.1mol/L磷酸缓冲液(pH=6.5)1000ml用蒸馏水稀 释至2000ml。 3、0,2molL类儿茶酚：称取类儿茶酚248g用蒸馏水溶解后转入100ml容量瓶，定容 至刻度后摇匀 4、0.3%H02:取1ml30%02稀释至100ml 5、3%H02:取10ml30%H02稀释至100ml 6、1%愈创木酚：吸限愈创木酚1ml,加入50%乙醇99ml,混匀即成 7、反应混合液A:100ml0.05molL磷酸缓冲液+10ml1%愈创木酚+10ml0.3%H0, 四、材料：新鲜油梨界 五、方法与步骤： 1、粗酶液制备：随机取油梨果若干，去掉果皮和核，称取果肉40g,置入匀浆器中， 加入130ml0.05mdL磷酸缓冲液匀浆3分钟，将匀浆通过四层纱布过滤后再将滤液于 8
8 实验五 多酚氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性测定 一、 原理 多酚氧化酶，过氧化氢酶和过氧化物酶是与植物衰老生理密切相关的酶，也常用作为水 果贮藏过程中衰老程度的指标。 ㈠、 多酚氧化酶：多酚氧化酶是一种以简单的铜离子作为辅基的酶，它能利用空气中 的氧将类儿萘酚氧化成褐色化合物： CH3 OH +O2 多酚氧化酶 CH3 O OH O ㈡、 过氧化氢酶：过氧化氢酶是一种以铁为辅基的酶。在催化过程中，一分子过氧化 氢酶与一分子过氧化氢结合，生成具有活性的中间产物，这个中间产物能催化另一分子过氧 化氢分解生成水和氧分子。 E + H2O2 E—H2O2 过氧化氢酶 活性物质 E—H2O2 + E—H2O2 E + 2H2O + O2↑ ㈢、 过氧化物酶：在过氧化氢存在时，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物 质： O.C6H3 (OCH3) .C6H3 (OCH3) .O HO +4H2O2 过氧化物酶 OCH3 O.C6H3 (OCH3) .C6H3 (OCH3) .O 二、 仪器设备 1、匀浆机 2、漏斗 3、纱布 4、离心机 5、吸量管：5ml×4；1ml×4； 10ml×2 6、量筒 200ml×1 7、抄表 8 分光光度计 9、微量进样器 50ml 三、 药品 1、 1mol/L 磷酸(pH=6.5)缓冲液：称取 9.45g NaH2PO4.2H2O 用蒸馏水溶解，定量转入 2000ml 容量瓶中；再称取 8.45g Na2HPO4.7H2O(或 11.3g Na2HPO4.12H2O)用蒸馏水溶解定 量转入同一容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度，摇匀。 2、 0.05mol/L 磷酸(pH=6.5)缓冲液：取 0.1mol/L 磷酸缓冲液(pH=6.5)1000ml 用蒸馏水稀 释至 2000ml。 3、 0.2mol/L 类儿茶酚：称取类儿茶酚 2.48g 用蒸馏水溶解后转入 100ml 容量瓶，定容 至刻度后摇匀。 4、 0.3％H2O2：取 1ml 30％ H2O2 稀释至 100ml 5、 3％H2O2：取 10ml 30％ H2O2 稀释至 100ml 6、 1%愈创木酚：吸限愈创木酚 1ml，加入 50％乙醇 99ml，混匀即成 7、 反应混合液 A：100ml 0.05 mol/L 磷酸缓冲液+10ml 1%愈创木酚+10ml 0.3％H2O2 四、 材料：新鲜油梨果 五、 方法与步骤： 1、 粗酶液制备：随机取油梨果若干，去掉果皮和核，称取果肉 40g，置入匀浆器中， 加入 130ml 0.05 mol/L 磷酸缓冲液匀浆 3 分钟，将匀浆通过四层纱布过滤后再将滤液于
15.000g下离心15分钟，取上层清液，即为粗酶液。 2、酶活性测定 多酚氧化酶：取1.5ml0.1 4NaPi(PH=-6.5)缓冲液放入比色杯中，再加1.5ml0.2M类 儿茶酚，最后加入22.5μ1粗酶液，用1.5cm2的硫酸纸盖好比色杯摇匀，立即计时在410nm 处进行测定，每隔半分钟测一次，测定前三分钟内的OD410 酶活=△0D1 △OD41o “定时间内0D值的变化 T一一测定时间 白过氧化氢酶：取3%hO20.3ml置入石英比色杯中，再加1.5ml0.1 M NaPi(PH=6.5) 缓冲液，然后再加1ml蒸馏水，最后加入0.1ml粗酶液，立即用硫酸好摇匀，于240nm 处计时测定，每半分钟测一次，共测3分钟 △OD240 酶活= △OD240 定时间内0D值的变化 T一一测定时间 白过氧化物酶：取3ml反应介质A置比色杯中，再加301粗酶液，立即混合后于 470nm处进行比色测定，每半分钟 一次，共测3分钟。 酶活= △0D40 T △OD4D 一一定时间内D值的变化 一一测定时间 六、注意事项 1、本实验法得到的醇液是粗酶液，含有沉降系数相似的其他酶类或非酶类杂质，若 想得到较纯的酶液可以通过0.5 MnaPi(PH=6.5)缓冲液中透析过夜得到。 2、计算酶活时，取值变化同时间呈线性关系的一段为宜。 参考文献 1、Jo arnal of Food Sciencl,Nov/DEC1983 Vol48 NO6 2、华东师大《植物生理学实验指导) 3、北京大学《生物化学实验指导》 4、XH波钦诺克《植物生物化学分析法》
9 15,000g 下离心 15 分钟，取上层清液，即为粗酶液。 2、 酶活性测定 ㈠ 多酚氧化酶：取 1.5ml 0.1M NaPi(PH=6.5)缓冲液放入比色杯中，再加 1.5ml 0.2M 类 儿茶酚，最后加入 22.5μl 粗酶液，用 1.5cm2 的硫酸纸盖好比色杯摇匀，立即计时在 410nm 处进行测定，每隔半分钟测一次，测定前三分钟内的 OD410 酶活= ΔOD410 T ΔOD410 ——一定时间内 OD 值的变化 T——测定时间 ㈡ 过氧化氢酶：取 3％H2O2 0.3ml 置入石英比色杯中，再加 1.5ml 0.1M NaPi(PH=6.5) 缓冲液，然后再加 1ml 蒸馏水，最后加入 0.1ml 粗酶液，立即用硫酸好摇匀，于 240nm 处计时测定，每半分钟测一次，共测 3 分钟。 酶活= ΔOD240 T ΔOD240 ——一定时间内 OD 值的变化 T——测定时间 ㈢ 过氧化物酶：取 3ml 反应介质 A 置比色杯中，再加 30μl 粗酶液，立即混合后于 470nm 处进行比色测定，每半分钟测一次，共测 3 分钟。 酶活= ΔOD470 T ΔOD470 ——一定时间内 OD 值的变化 T——测定时间 六、 注意事项： 1、 本实验法得到的酶液是粗酶液，含有沉降系数相似的其他酶类或非酶类杂质，若 想得到较纯的酶液可以通过 0.5MnaPi(PH=6.5)缓冲液中透析过夜得到。 2、 计算酶活时，取值变化同时间呈线性关系的一段为宜。 参考文献 1、 Journal of Food Sciencl,Nov/DEC1983 Vol48 NO6 2、 华东师大《植物生理学实验指导》 3、 北京大学《生物化学实验指导》 4、 X.H 波钦诺克《植物生物化学分析法》